CH640827A5

CH640827A5 - Process for preparing novel peptides

Info

Publication number: CH640827A5
Application number: CH702277A
Authority: CH
Inventors: Wylie Walker Jun Vale; Jean Edouard Frederic Rivier; Marvin Ross Brown
Original assignee: Salk Inst For Biological Studi
Priority date: 1976-06-07
Filing date: 1977-06-07
Publication date: 1984-01-31
Also published as: NL7706002A; JPS6315280B2; AU509631B2; FR2375190B1; GB1567341A; IL52231A0; JPS52156885A; DK250977A; AU2577577A; SE7706567L; FR2375190A1; DE2725735A1; SE441452B; IL52231A; CA1102313A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von neuen Peptiden, welche eine spezifische biologische Aktivität in bezug auf die Hemmung der Wachstumshormon-, Insulin- und Glucagonsekretion zeigen. Ganz besonders betrifft diese Erfindung erfindungsge-mäss herstellbare neue Peptide, welche wirksam sind, um selektiv nur die Freisetzung von Wachstumshormonen durch schleimabsondernde Drüsen oder die Freisetzung von Glu-cagon oder Insulin durch die Bauchspeicheldrüse zu hemmen. The present invention relates to a process for the preparation of new peptides which show a specific biological activity with respect to the inhibition of growth hormone, insulin and glucagon secretion. This invention particularly relates to novel peptides which can be prepared according to the invention and which are effective to selectively inhibit only the release of growth hormones by mucus-secreting glands or the release of glucagon or insulin by the pancreas.

Ein Peptid, welches eine eindämmende Wirkung auf die Sekretion von Wachstumshormonen zeigt, ist im US-Patent Nr. 3 904 594 von Guillemin et al. charakterisiert und beschrieben worden. Dieses Peptid erhielt den Namen «Soma-tostatin». Somatostatin, auch bekannt als «Eindämmender Faktor für die Somatotropin-Freisetzung» ist ein Tetradeca-peptid der Formel A peptide that has a curbing effect on growth hormone secretion is described in US Patent No. 3,904,594 to Guillemin et al. characterized and described. This peptide was given the name "soma-tostatin". Somatostatin, also known as the "containment factor for somatotropin release", is a tetradecapeptide of the formula

H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH. H-Ala-Gly-Cys-Lys-Asn-Phe-Phe-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-Ser-Cys-OH.

Somatostatin, die lineare Form von Somatostatin (Di-hydrosomatostatin) und verschiedene acylierte Derivate von Somatostatin und Dihydrosomatostatin wurden in der vorher erwähnten US-Patentanmeldung beschrieben. Somatostatin, the linear form of somatostatin (di-hydrosomatostatin), and various acylated derivatives of somatostatin and dihydrosomatostatin have been described in the aforementioned U.S. patent application.

Somatostatin und viele Analoga von Somatostatin zeigen eine Aktivität im Hinblick auf die Hemmung der Sekretion von Wachstumshormonen (GH) aus in vitro gezüchteten, dispergierten, vorher schleimabsordernden Rattenzellen und weisen in vivo eine Eindämmung der Insulin- und Glucagonsekretion in der Ratte auf. Man hat es beim Gebrauch von Somatostatin als höchst wünschenswert betrachtet, selektiv die Sekretion von Wachstumshormonen, Insulin oder GIu-cagon einzuschränken. Es wurden Anstrengungen unternommen, um Analoga von Somatostatin zu entwickeln, welche eine spezifische, biologische Aktivität zeigen und ausschliesslich die Sekretion von Wachstumshormonen, Insulin oder Glucagon hemmen. Obwohl es Veröffentlichungen gab, in welchen Unterschiede in den Mengen Somatostatin wiedergegeben sind, welche zur Eindämmung von Insulin im Vergleich zu Glucagon in der menschlichen und in vitro durchgesetzten Bauchspeicheldrüse von Ratten notwendig sind, zeigen Somatostatin und einige Somatostatin-Analoga ähnliche Wirksamkeiten in bezug auf die Hemmung dieser beiden Hormone. Somatostatin and many analogs of somatostatin show activity in inhibiting growth hormone (GH) secretion from in vitro grown, dispersed, previously mucus-releasing rat cells and have been shown to contain insulin and glucagon secretion in the rat in vivo. When using somatostatin, it has been considered highly desirable to selectively limit the secretion of growth hormones, insulin or GIu-cagon. Efforts have been made to develop analogues of somatostatin that show specific biological activity and only inhibit the secretion of growth hormones, insulin or glucagon. Although there have been publications showing differences in the amounts of somatostatin that are necessary to contain insulin compared to glucagon in the human and in vitro rat pancreas, somatostatin and some somatostatin analogues show similar efficacy in relation to that Inhibition of these two hormones.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Entdek-kung, dass gewisse Aminosäuren in Somatostatin und Dihydrosomatostatin durch andere Aminosäuren ersetzt werden können, um Peptide herzustellen, welche ein spezifische, biologische Aktivität im Hinblick auf die Hemmung der Sekretion von Wachstumshormonen, Insulin oder Glucagon besitzen. In einer üblichen Kurzfassung werden die neuen erfindungsgemäss herstellbaren Peptide in der Form einer The present invention relates to the discovery that certain amino acids in somatostatin and dihydrosomatostatin can be replaced by other amino acids to produce peptides which have a specific biological activity with a view to inhibiting the secretion of growth hormones, insulin or glucagon. In a conventional summary, the new peptides that can be produced according to the invention are in the form of a

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3 3rd

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Aminosäure-Einheit beschrieben, und zuvor ist die Art der Substitution, die Stelle der Substitution und die Tatsache, ob die Substitution in Somatostatin (SS) oder Dihydrosoma-tostatin (DHSS) erfolgt, angegeben. Die Nomenklatur, welche zur Beschreibung der erfindungsgemäss herstellbaren neuen Peptide verwendet wird, steht in Übereinstimmung mit herkömmlichen Regeln; in Übereinstimmung mit diesen Regeln stellt sie die L-Form der gewünschten Aminosäure dar, es sei denn etwas anderes sei ausdrücklich angegeben. Amino acid unit is described, and the type of substitution, the location of the substitution and the fact whether the substitution takes place in somatostatin (SS) or dihydrosomotatstatin (DHSS) is given above. The nomenclature used to describe the new peptides that can be produced according to the invention is in accordance with conventional rules; in accordance with these rules, it represents the L-form of the desired amino acid, unless expressly stated otherwise.

Zweckmässigerweise werden in den neuen erfindungsgemäss herstellbaren Peptiden die individuellen Aminosäuren des Peptides von links nach rechts numeriert. The individual amino acids of the peptide are expediently numbered from left to right in the new peptides which can be prepared according to the invention.

Das erste erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von neuen Peptiden mit pharmazeutischer Verwendbarkeit der Formel II The first method according to the invention for the production of new peptides with pharmaceutical utility of the formula II

H-Ala-Gly-X-Lys-X1-Phe-Phe-X2-Lys-Thr-Phe-Thr-X3-X4 H-Ala-Gly-X-Lys-X1-Phe-Phe-X2-Lys-Thr-Phe-Thr-X3-X4

(II) (II)

und den nicht-toxischen Salzen davon, ist dadurch gekennzeichnet, dass man durch Verbinden der einzelnen Aminosäuren ein Peptid-Zwischenprodukt der Formel III and the non-toxic salts thereof, is characterized in that a peptide intermediate of the formula III

R-Ala-Gly-X-(R1)-Lys(R2)-(X1)-Phe-Phe-(X2)-Lys(R3)-Thr-(R4)-Ph.e-Thr(R5)-(Xa)-(R6)-(X4)-(R7)-(X5) (III) R-Ala-Gly-X- (R1) -Lys (R2) - (X1) -Phe-Phe- (X2) -Lys (R3) -Thr- (R4) -Ph.e-Thr (R5) - ( Xa) - (R6) - (X4) - (R7) - (X5) (III)

bildet, worin forms what

X ausgewählt ist aus Cys und D-Cys; X is selected from Cys and D-Cys;

Xj ist ausgewählt aus Asn und Des-Asn; Xj is selected from Asn and Des-Asn;

X2 ist ausgewählt aus Trp und D-Trp; X2 is selected from Trp and D-Trp;

X3 ist ausgewählt aus Ser und D-Ser; und X4 ist ausgewählt aus Cys und D-Cys, X3 is selected from Ser and D-Ser; and X4 is selected from Cys and D-Cys,

mit der Massgabe, dass mindestens eine der Gruppen X3 und X4 D-Ser bzw. D-Cys bedeutet; with the proviso that at least one of the groups X3 and X4 is D-Ser or D-Cys;

R ist ausgewählt aus der Klasse, bestehend aus H und einer alpha-Amino-Schutzgruppe; R is selected from the class consisting of H and an alpha-amino protecting group;

R1 und R7 sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus H und einer Schutzgruppe für Cys, ausgewählt aus S-p-Methoxybenzyl, S-p-Methylbenzyl, S-Acetamidomethyl, S-Trityl und S-Benzyl; R1 and R7 are selected from the group consisting of H and a protecting group for Cys selected from S-p-methoxybenzyl, S-p-methylbenzyl, S-acetamidomethyl, S-trityl and S-benzyl;

R2 und R3 sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus R2 and R3 are selected from the group consisting of

H und einer Seitenkette-Amino-Schutzgruppe; H and a side chain amino protecting group;

R4, R5 und R6 sind ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus H und einer Hydroxyl-Schutzgruppe, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Acetyl, Benzoyl, tert-Butyl, Benzyl und Benzyloxycarbonyl; R4, R5 and R6 are selected from the group consisting of H and a hydroxyl protecting group selected from the group consisting of acetyl, benzoyl, tert-butyl, benzyl and benzyloxycarbonyl;

mit der weiteren Massgabe, dass wenigstens einer der Reste R, R1, R2, R3, R4, R5, R6 und R7 eine andere Bedeutung hat als Wasserstoff; und with the further proviso that at least one of the radicals R, R1, R2, R3, R4, R5, R6 and R7 has a different meaning than hydrogen; and

Xs ist ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Hydroxy, Estern, vorzugsweise Methoxy, Amiden, Hydraziden, -0-CH2-Polystyrol-Harzträger und 0-CH2-Benzyl-poly-styrol-Harzträger, Xs is selected from the group consisting of hydroxy, esters, preferably methoxy, amides, hydrazides, -0-CH2-polystyrene resin carrier and 0-CH2-benzyl-poly-styrene resin carrier,

die Schutzgruppe oder die Schutzgruppen aus der intermediären Verbindung der Formel III abspaltet, und, falls X5 einen Harzträger bedeutet, das Peptid vom Harz abspaltet, und gegebenenfalls von erhaltenen Verbindungen die nichttoxischen Salze herstellt. cleaves the protective group or groups from the intermediate compound of the formula III, and, if X5 denotes a resin support, cleaves the peptide from the resin, and optionally produces the non-toxic salts from the compounds obtained.

Das zweite erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von neuen Peptiden mit pharmazeutischer Verwendbarkeit der Formel I The second method according to the invention for the production of new peptides with pharmaceutical utility of formula I.

H-AIa-Gly-X-Lys-X1-Phe-Phe-X2-Lys-Thr-Phe-Thr-X3-I H-AIa-Gly-X-Lys-X1-Phe-Phe-X2-Lys-Thr-Phe-Thr-X3-I

X4 (I) X4 (I)

worin die Substituenten weiter oben definiert sind, und den nicht-toxischen Salzen davon, ist dadurch gekennzeichnet, dass man Peptide der Formel II gemäss dem oben beschriebenen ersten erfindungsgemässen Verfahren herstellt und anschliessend die Peptide oxidiert, um eine Disulfid-Bindung zwischen den genannten Cys-Resten herzustellen, und gegebenenfalls von so erhaltenen Verbindungen die nicht-toxischen Salze herstellt. in which the substituents are defined further above, and the non-toxic salts thereof, is characterized in that peptides of the formula II are prepared in accordance with the first process according to the invention described above and the peptides are then oxidized in order to form a disulfide bond between the cysts mentioned. Produce residues, and optionally the compounds thus obtained, the non-toxic salts.

Beispiele von neuen erfindungsgemäss herstellbaren Peptiden, welche eine spezifische, biologische Aktivität in bezug auf die Freisetzung von Wachstumshormonen, Insulin und Glucagon zeigen, sind: [D-Ser13]-SS; [D-Ser13]-DHSS; [D-Trp8] - [D-Ser13] -SS; [D-Trp8]-[D-Ser13]-DHSS; [D-Cys14]-SS; [D-Cys14]-DHSS; [D-Trp8]-[D-Cys14]SS und [D-Trp8] -[D-Cys14] DHSS. Examples of new peptides which can be prepared according to the invention and which have a specific biological activity with regard to the release of growth hormones, insulin and glucagon are: [D-Ser13] -SS; [D-Ser13] -DHSS; [D-Trp8] - [D-Ser13] -SS; [D-Trp8] - [D-Ser13] -DHSS; [D-Cys14] -SS; [D-Cys14] -DHSS; [D-Trp8] - [D-Cys14] SS and [D-Trp8] - [D-Cys14] DHSS.

Pharmazeutisch annehmbare Säureadditionssalze der Peptide befinden sich ebenfalls innerhalb des Bereiches der vorliegenden Erfindung. Solche Säureadditionssalze sind beispielsweise das Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Phosphat, Maleat, Acetat, Citrat, Benzoat, Succinat, Malat, Ascorbat, Tartrat, usw. Pharmaceutically acceptable acid addition salts of the peptides are also within the scope of the present invention. Such acid addition salts are, for example, the hydrochloride, hydrobromide, sulfate, phosphate, maleate, acetate, citrate, benzoate, succinate, malate, ascorbate, tartrate, etc.

Vorzugsweise werden Verbindungen hergestellt, worin X die Bedeutung hat von D-Cys, Xx bedeutet Asn, X2 bedeutet Trp, X3 bedeutet Ser, und X4 bedeutet D-Cys; sowie Verbindungen, worin X die Bedeutung hat von D-Cys, Xi bedeutet Asn, X2 bedeutet Trp, X3 bedeutet D-Ser, und X4 bedeutet Cys. Compounds are preferably prepared in which X is D-Cys, Xx is Asn, X2 is Trp, X3 is Ser and X4 is D-Cys; as well as compounds in which X has the meaning of D-Cys, Xi means Asn, X2 means Trp, X3 means D-Ser, and X4 means Cys.

Die a-Amino-Schutzgruppen, welche durch R bezeichnet werden, sind diejenigen, welche in der Technik als nützlich bekannt sind bei der stufenweisen Synthese der Polypeptide. Unter der Klasse von a-Amino-Schutzgruppen, welche R umfasst, sind beispielsweise folgende: (1) Schutzgruppen vom Typ der Acylreste, wie Formyl, Trifluoracetyl, Phthalyl, Toluolsulfonyl (Tosyl), Benzolsulfonyl, Nitrophe-nylsulfenyl, Tritylsulfenyl, o-Nitrophenoxyacetyl, Chlor-acetyl, Acetyl, y-Chlorbutyrul, usw.; (2) Schutzgruppen vom Typ der aromatischen Urethane, wie Benzyloxycarbonyl und substituiertes Benzyloxycarbonyl, wie p-Chlorbenzyloxy-carbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxy-carbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl; (3) Schutzgruppen von Typ der aliphatischen Urethane, wie a-t-Butyloxy-carbonyl, Diisopropylmethoxycarbonyl, Isopropyloxycarbo-nyl, Äthoxycarbonyl, Allyloxycarbonyl; (4) Schutzgruppen vom Typ der Cycloalkylurethane, wie Cyclopentyloxycarbo-nyl, Adamantyloxycarbonyl, Cyclohexyloxycarbonyl; (5) Schutzgruppen vom Typ der Thiourethane, wie Phenylthio-carbonyl; (6) Schutzgruppen vom Typ der Alkylreste, wie Triphenylmethyl (Trityl), Benzyl; (7) Trialkylsilangruppen, wie Trimethylsilan. Eine bevorzugte mit R definierte a-Ami-no-Schutzgruppe ist t-Butyloxycarbonyl. The a-amino protecting groups denoted by R are those which are known in the art to be useful in the stepwise synthesis of the polypeptides. The class of a-amino protecting groups which R includes include, for example, the following: (1) protecting groups of the acyl radical type, such as formyl, trifluoroacetyl, phthalyl, toluenesulfonyl (tosyl), benzenesulfonyl, nitrophenylsulfenyl, tritylsulfenyl, o-nitrophenoxyacetyl , Chloroacetyl, acetyl, y-chlorobutyrul, etc .; (2) aromatic urethane type protecting groups such as benzyloxycarbonyl and substituted benzyloxycarbonyl such as p-chlorobenzyloxycarbonyl, p-nitrobenzyloxycarbonyl, p-bromobenzyloxycarbonyl, p-methoxybenzyloxycarbonyl; (3) aliphatic urethane type protecting groups such as a-t-butyloxycarbonyl, diisopropylmethoxycarbonyl, isopropyloxycarbonyl, ethoxycarbonyl, allyloxycarbonyl; (4) cycloalkyl urethane type protecting groups such as cyclopentyloxycarbonyl, adamantyloxycarbonyl, cyclohexyloxycarbonyl; (5) thiourethane type protecting groups such as phenylthiocarbonyl; (6) protecting groups of the alkyl radical type, such as triphenylmethyl (trityl), benzyl; (7) trialkylsilane groups such as trimethylsilane. A preferred a-amino protecting group defined with R is t-butyloxycarbonyl.

R1 und R7 stellen beide eine Schutzgruppe für Cys oder D-Cys dar, wobei diese aus der Gruppe von S-p-Methoxy-benzyl, S-p-Methylbenzyl, S-Acetamidomethyl, S-Trityl, S-Benzyl usw. ausgewählt sind. Eine bevorzugte Schutzgruppe ist S-p-Methoxybenzyl. R1 und/oder R7 können Wasserstoff darstellen, was heisst, dass keine Schutzgruppe auf der Thiolgruppe vorhanden ist. R1 and R7 both represent a protecting group for Cys or D-Cys, which are selected from the group of S-p-methoxy-benzyl, S-p-methylbenzyl, S-acetamidomethyl, S-trityl, S-benzyl, etc. A preferred protecting group is S-p-methoxybenzyl. R1 and / or R7 can represent hydrogen, which means that there is no protective group on the thiol group.

R2 und R3 stellen beide eine Schutzgruppe für einen Seitenketten-Aminosubstituenten von Lysin dar oder R2 und/oder R3 stehen für Wasserstoff, was bedeutet, dass keine Schutzgruppe auf einem Amino-Substituenten einer Seitenkette vorliegt. Beispiele von geeigneten Schutzgruppen für eine Seitenkette-Aminogruppe sind Benzyl, Chlorbenzyl-oxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl, Tosyl, t-Amyloxycarbonyl, t-Butyloxycarbonyl usw. Die Auswahl einer solchen Amino-Schutzgruppe einer Seitenkette ist nicht entscheidend, ausser, dass sie so beschaffen sein soll, dass sie während der Wegnahme der a-Amino-Gruppen im Verlaufe der Synthese nicht entfernt wird. Folglich können die >«-Amino-Schutz- R2 and R3 both represent a protecting group for a side chain amino substituent of lysine or R2 and / or R3 represent hydrogen, which means that there is no protecting group on an amino substituent of a side chain. Examples of suitable protecting groups for a side chain amino group are benzyl, chlorobenzyloxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, tosyl, t-amyloxycarbonyl, t-butyloxycarbonyl, etc. The selection of such an amino protecting group for a side chain is not critical, except that it is intended to be such that it is not removed during the synthesis during the removal of the a-amino groups. As a result, the> «amino protection

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gruppe und die Schutzgruppe für die Seitenketten-Amino-funktion nicht die gleichen sein; group and the protecting group for the side chain amino function may not be the same;

R4, R5 und R6 sind Schutzgruppen für die Hydroxylgruppe von Thr und Ser, und sie werden aus der Gruppe von Acetyl, Benzoyl, t-Butyl, Trityl, Tetrahydropyranyl, Benzyl, 2,6-Dichlorbenzyl und Benzyloxycarbonyl ausgewählt. Eine bevorzugte Schutzgruppe ist der Benzylrest. R4 und/oder R5 und/oder R6 können aber auch Wasserstoff darstellen, was bedeutet, dass keine Schutzgruppe auf der Hydroxylgruppe vorhanden ist. R4, R5 and R6 are protecting groups for the hydroxyl group of Thr and Ser, and they are selected from the group of acetyl, benzoyl, t-butyl, trityl, tetrahydropyranyl, benzyl, 2,6-dichlorobenzyl and benzyloxycarbonyl. A preferred protecting group is the benzyl radical. R4 and / or R5 and / or R6 can also represent hydrogen, which means that there is no protective group on the hydroxyl group.

Xv X2, X3 und X4 werden wie oben definiert. X5 wird aus der Gruppe von OH, Estern, beispielsweise OCH3, Amiden, Hydraziden, Xv X2, X3 and X4 are defined as above. X5 is selected from the group of OH, esters, for example OCH3, amides, hydrazides,

-0-CH2-Polystyrol-Harzträger und -0-CH2 polystyrene resin support and

0-CH2-Benzylpolystyrol-Harzträger ausgewählt. 0-CH2-Benzylpolystyrene resin support selected.

Das Polymer ist bevorzugt ein Copolymer aus Styrol mit etwa 0,5 bis 2% Divinylbenzol als Querverbindungsmittel, was ein Polystyrol-Polymer ergibt, welches vollständig unlöslich in gewissen organischen Lösungsmitteln ist. In Formel III stellt mindestens einer der Reste R, R1, R2, R3, R4, R5, R6 und R7 eine Schutzgruppe dar. The polymer is preferably a copolymer of styrene with about 0.5 to 2% divinylbenzene as a crosslinking agent, resulting in a polystyrene polymer which is completely insoluble in certain organic solvents. In formula III, at least one of the radicals R, R1, R2, R3, R4, R5, R6 and R7 represents a protective group.

Bei der Auswahl einer besonderen Seitenketten-Schutzgruppe, welche in der Synthese der Peptide der Formel I oder Formel II eingesetzt wird, sollen vorzugsweise die folgenden Regeln aufgeführt werden: When selecting a special side chain protecting group which is used in the synthesis of the peptides of the formula I or formula II, the following rules should preferably be listed:

(a) die Schutzgruppe muss so stabil sein, dass sie den Reagenzien und den zur Entfernung der «-Amino-Schutz-gruppe verwendeten Reaktionsbedingungen bei jeder Stufe der Synthese widersteht, (a) the protecting group must be stable enough to withstand the reagents and reaction conditions used to remove the "amino protecting group at each stage of the synthesis,

(b) die Schutzgruppe muss ihre schützenden Eigenschaften behalten und darf während den Verbindungsbedingungen nicht abgespalten werden, und (b) the protecting group must retain its protective properties and must not be split off during the connection conditions, and

(c) die Schutzgruppe der Seitenkette muss bei der Vervollständigung der Synthese entfernbar sein, wobei diese die gewünschte Reihenfolge der Aminosäuren unter den Reaktionsbedingungen enthält, welche die Peptidkette nicht verändern sollen. (c) The protecting group of the side chain must be removable upon completion of the synthesis, which contains the desired order of the amino acids under the reaction conditions, which should not change the peptide chain.

Die Peptide der Formeln I und II können durch Verwendung einer Synthese in fester Phase hergestellt werden. Man beginnt zweckmässig mit der Synthese beim C-end-ständigen Ende des Peptides, wobei eine a-Amino geschützte Aminosäure eingesetzt wird. Ein solches Ausgangsmaterial kann durch Verbindung eines Cys mit einer geschützten a-Aminogruppe und einem geschützten Schwefel an ein chlormethyliertes Harz oder ein Hydroxymethylharz hergestellt werden. Die Herstellung eines Hydroxymethyl-Har-zes wurde von Bodanszky et al., Chem. Inc. (London) 38, 1957-98 (1966) beschrieben. Ein chlormethyliertes Harz ist kommerziell erhältlich von Bio Rad Laboratories, Richmond, California; die Herstellung eines solchen Harzes wurde von Stewart et al., «Solid Phase Peptide Synthesis» (Free-man & Co., San Francisco 1969) beschrieben, Kapitel 1, Seiten 1-6. Cys mit der geschützten a-Aminogruppe und dem geschützten S wird an das chlormethylierte Harz zweckmässig nach dem Verfahren von Monahan and Gilon, Biopolymer 12, Seiten 2513-19, 1973 gebunden. Nach der Bindung des Cys mit der geschützten a-Aminogruppe und dem geschützten S an den Harzträger, wird die a-Amino-Schutzgruppe entfernt, wobei beispielsweise Trifluoressig-säure in Methylenchlorid, Trifluoressigsäure allein oder HCl in Dioxan verwendet werden kann. Die Wegnahme der Schutzgruppe wird vorzugsweise bei einer Temperatur zwischen etwa 0°C und Raumtemperatur ausgeführt. The peptides of formulas I and II can be prepared using solid phase synthesis. It is expedient to begin the synthesis at the C-end of the peptide, using an a-amino-protected amino acid. Such a starting material can be prepared by connecting a Cys having a protected a-amino group and a protected sulfur to a chloromethylated resin or a hydroxymethyl resin. The preparation of a hydroxymethyl resin was described by Bodanszky et al., Chem. Inc. (London) 38, 1957-98 (1966). A chloromethylated resin is commercially available from Bio Rad Laboratories, Richmond, California; the preparation of such a resin was described by Stewart et al., “Solid Phase Peptide Synthesis” (Free-man & Co., San Francisco 1969), chapter 1, pages 1-6. Cys with the protected a-amino group and the protected S is expediently bound to the chloromethylated resin by the method of Monahan and Gilon, Biopolymer 12, pages 2513-19, 1973. After the Cys with the protected a-amino group and the protected S have bonded to the resin support, the a-amino protecting group is removed, using, for example, trifluoroacetic acid in methylene chloride, trifluoroacetic acid alone or HCl in dioxane. The protective group is preferably removed at a temperature between about 0 ° C. and room temperature.

Andere Standard-Spaltungsreagentien und -bedingungen zur Entfernung von spezifischen a-Amino-Schutzgruppen können ebenfalls eingesetzt werden, sowie sie in Schröder & Lubke, «The Peptides», 1 Seiten 72-75 (Academic Press 1965) beschrieben sind. Other standard cleavage reagents and conditions for removing specific a-amino protecting groups can also be used, as described in Schröder & Lubke, "The Peptides", 1 pages 72-75 (Academic Press 1965).

Nach der Entfernung der a-Amino-Schutzgruppe vom Cys werden vorzugsweise die verbleibenden Aminosäuren mit geschützten a-Aminogruppen und Seitenketten stufenweise in der gewünschten Ordnung zusammengefügt, um eine Verbindung der Formel III zu erhalten oder, statt dass man jede einzelne Aminosäure getrennt in die Synthese gibt, können einige von diesen vor der Zugabe in den Feststoff-Reaktor vereinigt werden. Die Auswahl eines geeigneten Kupplungsreagenzes ist für einen Fachmann gut zugänglich. NJSP-Dicyclohexylcarbodiimid stellt ein besonders geeignetes Kupplungs-Reagenz dar. After removal of the a-amino protecting group from the Cys, the remaining amino acids with protected a-amino groups and side chains are preferably combined stepwise in the desired order in order to obtain a compound of the formula III or instead of having to separate each individual amino acid into the synthesis there may be some of these combined before adding to the solid reactor. The selection of a suitable coupling reagent is readily accessible to a person skilled in the art. NJSP-dicyclohexylcarbodiimide is a particularly suitable coupling reagent.

Die aktivierenden Reagenzien, welche in der Synthese der Peptide in fester Phase eingesetzt werden, sind vorzugsweise solche, welche in der Peptidchemie wohl bekannt sind. Beispiele von geeigneten Aktivierungsreagentien sind: (1) Carbodiimide, wie N,N-Diisopropylcarbodiimid, N-Äthyl Nx-(y-dimethylaminopropylcarbodiimid; (2) Cyanamid, wie N,N-dibenzylcyanamid; (3) Keteimine; (4) Isoxazoliumsalze, wie N-Äthyl-5-phenylisoxazolium-3l-sulfonat; (5) monocy-clische stickstoffhaltige heterocyclische Amide von aromatischer Natur welche 1 bis 4 Stickstoffe im Ring enthalten, beispielsweise Imidazolid, Pyrazolid, 1,2,4-Triazolid. Spezifische heterocyclische Amide, welche nützlich sind, umfassen NjN^Carbonyldiimidazol, N^-Carbonyl-di-1,2,4-tri-azol; (6) alkoxyliertes Acetylen, wie Äthoxyacetylen; (7) Rea-gentien, welche ein gemischtes Anhydrid mit der Carboxyl-Einheit der Aminosäure bilden, wie Äthylchloroformiat und Isobutylchloroformiat und (8) stickhoffhaltige heterocyclische Verbindungen, welche eine Hydroxygruppe auf einem Ringstickstoff haben, wie N-Hydroxyphthalimid, N-Hydroxy-succinimid N-Hydroxybenzotriazol. Andere aktivierende Reagentien und ihr Gebrauch beim Zusammenfügen der Peptide sind von Schröder & Lubke supra, in Kapitel III und von Kapoor, J. Pharm. Sei., 59, Zeilen 1-27 (1970) beschrieben worden. The activating reagents which are used in the synthesis of the solid phase peptides are preferably those which are well known in peptide chemistry. Examples of suitable activation reagents are: (1) carbodiimides, such as N, N-diisopropylcarbodiimide, N-ethyl Nx- (y-dimethylaminopropylcarbodiimide; (2) cyanamide, such as N, N-dibenzylcyanamide; (3) keteimines; (4) isoxazolium salts, such as N-ethyl-5-phenylisoxazolium-3l-sulfonate; (5) monocyclic nitrogen-containing heterocyclic amides of an aromatic nature which contain 1 to 4 nitrogen in the ring, for example imidazolide, pyrazolide, 1,2,4-triazolide, specific heterocyclic amides which are useful include N ^ N ^ carbonyldiimidazole, N ^ carbonyl-di-1,2,4-tri-azole; (6) alkoxylated acetylene, such as ethoxyacetylene; (7) reagents which are a mixed anhydride with the carboxyl Form a unit of the amino acid, such as ethyl chloroformate and isobutyl chloroformate and (8) nitrogen-containing heterocyclic compounds which have a hydroxyl group on a ring nitrogen, such as N-hydroxyphthalimide, N-hydroxysuccinimide, N-hydroxybenzotriazole, other activating reagents and their use b The assembly of the peptides has been described by Schröder & Lubke supra, in Chapter III and by Kapoor, J. Pharm. Sei., 59, lines 1-27 (1970).

Jede geschützte Aminosäure oder Aminosäurefolge wird vorzugsweise in ungefähr vierfachem Überschuss in den Feststoff-Reaktor eingeführt, und das Zusammenfügen wird in einem Medium, welches aus Dimethylformamid: Methylenchlorid (1:1) oder in Dimethylformamid oder Methylenchlorid allein besteht, ausgeführt. In den Fällen, bei denen eine unvollständige Verbindung erfolgte, wurde das Verfahren des Zusammenfügens vor der Entfernung der a-Ami-no-Schutzgruppe, d.h. vor dem Anschluss der nächsten Aminosäure, normalerweise wiederholt. Der Erfolg der Zusam-menfügungsreaktion bei jeder Stufe der Synthese wird üblicherweise mit der Ninhydrin-Reaktion verfolgt, wie dies in E. Kaiser et al. Analyt. Biochem, 34, 595 (1970) beschrieben wurde. Each protected amino acid or amino acid sequence is preferably introduced into the solid state reactor in approximately fourfold excess and the assembly is carried out in a medium consisting of dimethylformamide: methylene chloride (1: 1) or in dimethylformamide or methylene chloride alone. In cases where incomplete connection occurred, the procedure for assembly prior to removal of the a-amino protecting group, i.e. before connecting the next amino acid, usually repeated. The success of the assembly reaction at each stage of the synthesis is usually followed by the ninhydrin reaction, as described in E. Kaiser et al. Analyte. Biochem, 34, 595 (1970).

Nachdem die gewünschte Aminosäure-Sequenz der Formel III synthetisiert worden war, wurde das Peptid vom Harzträger abgetrennt, indem eine Behandlung mit einem Reagens, wie beispielsweise flüssigem Fluorwasserstoff erfolgte, was nicht nur die Peptide vom Harz abtrennt, sondern auch alle übrigen Seitenketten-Schutzgruppen R1, R2, R3, R4, R5, R6 und R7 und die a-Amino-Schutzgruppe R abspaltet, um direkt ein Peptid der Formel II zu gewinnen. Peptide der Formel I werden erhalten, indem man Peptide der Formel II bpw. nach bekannten Verfahren oxidiert. Eine andere Synthese kann darin bestehen, das Peptid, welches an den Harzträger gebunden ist, durch Alkoholyse vom Harz abzutrennen, worauf der gewonnene C-endständige Methylester durch Hydrolyse in die Säure übergeführt wird'. Irgendeine Seitenketten-Schutzgruppe kann dann abgespalten werden, wie dies oben beschrieben wurde, oder nach anderen Verfahren, wie katalytischer Reduktion, z.B. Pd auf BaS04, wobei Bedingungen angewandt wurden, in welchen die Trp-Einheit unversehen bleibt. Wird Fluorwasserstoff After the desired amino acid sequence of Formula III was synthesized, the peptide was separated from the resin support by treatment with a reagent such as liquid hydrogen fluoride, which not only separates the peptides from the resin but also all other side chain protecting groups R1 , R2, R3, R4, R5, R6 and R7 and the a-amino protective group R split off to directly obtain a peptide of formula II. Peptides of formula I are obtained by using peptides of formula II bpw. oxidized by known methods. Another synthesis can consist in separating the peptide which is bound to the resin support from the resin by alcoholysis, whereupon the C-terminal methyl ester obtained is converted into the acid by hydrolysis. Any side chain protecting group can then be removed as described above or by other methods such as catalytic reduction, e.g. Pd on BaS04 using conditions in which the Trp unit remains undetected. Becomes hydrogen fluoride

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für die Spaltung eingesetzt, so setzt man zweckmässig Ani-sol in das Reaktionsgefäss als Reinigungsmittel ein. used for the cleavage, Ani-sol is expediently used in the reaction vessel as a cleaning agent.

Das oben diskutierte Verfahren der Synthese in fester Phase ist Fachleuten bekannt und wurde im wesentlichen in Merrifield J. Am. Soc., 85, S 2149 (1964) beschrieben. The solid phase synthesis method discussed above is known to those skilled in the art and has been essentially described in Merrifield J. Am. Soc., 85, S 2149 (1964).

Die erfindungsgemäss herstellbaren neuen Peptide, welche spezifische Wirkungen im Hinblick auf die Hemmung der Freisetzung von Wachstumshormonen, Insulin und Glucagon zeigen, werden beispielsweise als besonders wichtig im Zusammenhang mit der Behandlung von Diabetes angesehen. Die traditionelle Auffassung von Diabetes bestand darin, dass Beschwerden ausschliesslich auf eine ungenügende Insulinproduktion zurückzuführen sind. Als man eingehendere Forschungsversuche durchführte, wurde ersichtlich, dass etwas Somatostatin im Anschluss an eine Schwächung der Insulinsekretion wirksam gegen Diabetes ist. Es ist bekannt, dass, während Insulin normalerweise bei Diabetes in ungenügender Menge vorhanden ist, Glycagon gewöhnlich im Überschuss vorliegt. Es ist nun anerkannt, dass die Gegenwart von Glucagon mindestens einen so wichtigen Faktor bei Diabetes darstellt, wie das Fehlen von Insulin. The novel peptides which can be prepared according to the invention and which have specific effects with regard to the inhibition of the release of growth hormones, insulin and glucagon are regarded, for example, as being particularly important in connection with the treatment of diabetes. The traditional view of diabetes has been that symptoms can only be attributed to insufficient insulin production. As more extensive research was done, it became apparent that some somatostatin was effective against diabetes after weakening insulin secretion. It is known that while insulin is usually insufficient in diabetes, glycagon is usually in excess. It is now recognized that the presence of glucagon is at least as important a factor in diabetes as the lack of insulin.

Die Tatsache, dass ein Mangel an Insulin normalerweise von einem Überschuss an Glucagon begleitet ist, hat beim Erforschen der Rolle des Glucagons bei Diabetes Schwierigkeiten bereitet. Während es einfach ist, zusätzliche Mengen eines Hormons, wie Insulin, zuzugeben, hat es sich als schwierig erwiesen, den Gehalt an Glucagon zu senken. Die Entdeckung von Somatostatin hat die Forschungsarbeiten im Hinblick die Rolle des Glucagons in Diabetes erleichtert. Somatostatin hemmt sowohl die Freisetzung von Insulin als auch diejenige von Glucagon. Die Rolle von Somatostatin bei der Erforschung von Diabetes ist im Einzelnen in einem Artikel wiedergegeben, welcher in Science, Vol. 188, Zeilen 920-923, 30, Mai 1975 erschienen ist. Es bestehen jedoch mehrere Probleme in bezug auf die Verwendung von Somatostatin bei der Behandlung von Diabetes. Somatostatin hemmt die Freisetzung von Insulin bei der Zugabe von Glucagon. Somit wurde die Notwendigkeit, ein Peptid mit einer spezifischen Wirkung in bezug auf die Eindämmung der Freisetzung von Insulin und Glucagon herzustellen, im Zusammenhang mit der Behandlung von Diabetes anerkannt. Die neuen erfindungsgemäss herstellbaren Peptide bringen solche spezifische Wirksamkeiten mit sich. Ganz besonders wirksam sind gewisse der erfindungsgemäss herstellbaren neuen Peptide bei der Hemmung der Glucagonsekretion, während sie einen kleineren Einfluss auf die Einschränkung der Insulinsekretion zeigen. Die folgenden Beispiele erläutern verschiedene Eigenschaften der vorliegenden Erfindung. The fact that insulin deficiency is usually accompanied by an excess of glucagon has been difficult to explore in the role of glucagon in diabetes. While adding additional amounts of a hormone such as insulin is easy, it has proven difficult to lower the glucagon content. The discovery of somatostatin has facilitated research into the role of glucagon in diabetes. Somatostatin inhibits both insulin and glucagon release. The role of somatostatin in the study of diabetes is detailed in an article that appeared in Science, Vol. 188, lines 920-923, May 30, 1975. However, there are several problems with the use of somatostatin in the treatment of diabetes. Somatostatin inhibits the release of insulin when glucagon is added. Thus, the need to produce a peptide with a specific insulin and glucagon release control effect has been recognized in connection with the treatment of diabetes. The new peptides which can be prepared according to the invention have such specific efficacies. Certain of the new peptides that can be produced according to the invention are particularly effective in inhibiting glucagon secretion, while they have a smaller influence on the restriction of insulin secretion. The following examples illustrate various properties of the present invention.

Beispiel 1 example 1

Die neuen Peptide werden durch eine Synthese in fester Phase hergestellt, im allgemeinen in Übereinstimmung mit dem Verfahren, welches im US-Patent Nr. 3 904 594 beschrieben ist. Die Synthese wurde stufenweise auf chlor-methyliertem Harz durchgeführt. Das Harz war aus feinen Kügelchen (20-70 Mikron im Durchmesser) aus synthetischem Harz zusammengesetzt, welches durch Copolymerisa-tion von Styrol mit 1 bis 2% Divinylbenzol hergestellt wurde. Die Benzolringe im Harz wurden in einer Friedel-Crafts Reaktion mit Chlormethylmethyl-Äther und Zinn (IV) Chlorid chlormethyliert. Das somit eingeführte Chlor stellt ein reaktives Benzylchlorid dar, geeignet für Anschlussreaktionen. Die Friedel-Crafts Reaktion wird fortgesetzt, bis das Harz 0,5 bis 2 m Mole Chlor pro Gramm Harz enthält. The new peptides are made by solid phase synthesis, generally in accordance with the method described in U.S. Patent No. 3,904,594. The synthesis was carried out in stages on chloromethylated resin. The resin was composed of fine beads (20-70 microns in diameter) made of synthetic resin, which was prepared by copolymerization of styrene with 1 to 2% divinylbenzene. The benzene rings in the resin were chloromethylated in a Friedel-Crafts reaction with chloromethyl methyl ether and tin (IV) chloride. The chlorine thus introduced represents a reactive benzyl chloride, suitable for subsequent reactions. The Friedel-Crafts reaction continues until the resin contains 0.5 to 2 moles of chlorine per gram of resin.

In der weiteren Beschreibung der Peptidsynthese werden die verwendeten Reagentien zuerst anhand ihrer chemischen Namen mit ihren gebräuchlichen Abkürzungen in Klammern beschrieben. Anschliessend wird man sich auf die gebräuchlichen Abkürzungen beziehen. In the further description of peptide synthesis, the reagents used are first described in terms of their chemical names with their common abbreviations in parentheses. Then one will refer to the common abbreviations.

Ein Peptid der Formel A peptide of the formula

Ala-Gly-Cys-Lys-des-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr- Ala-Gly-Cys-Lys-des-Asn-Phe-Phe-D-Trp-Lys-Thr-Phe-Thr-

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Ser-Cys-OH I Ser-Cys-OH I

13 14 13 14

wurde synthetisiert, wobei die Methode in fester Phase verwendet wurde. Andere Peptide, welche anschliessend beschrieben sind, wurden nach ähnlichen Verfahren hergestellt. was synthesized using the solid phase method. Other peptides, which are described below, were produced by similar processes.

Das t-Butyloxycarbonyl-S-paramethoxybenzyl (Boc-SpOMe-Bzl)-Derivat von Cys wurde mit Hilfe eines der drei bekannten Verfahren an das Harz gebunden: (1) Erwärmen in Äthanol in Gegenwart von Triäthylamin; (2) das Cäsiumsalz der mit Boc geschützten Aminosäure wird bei 50°C in Dimethylformamid (DMF) gehalten; (3) das Kaliumsalz der Boc-geschützten Aminosäure wird bei 80°C in Dimethylsulfoxid (DMSO) während 2 Stunden gehalten. Nur ein Milliäquivalent des geschützten Cys pro Milliäqui-valent Cl auf dem Harz wurde verwendet. The Cys t-butyloxycarbonyl-S-paramethoxybenzyl (Boc-SpOMe-Bzl) derivative was bound to the resin using one of three known methods: (1) heating in ethanol in the presence of triethylamine; (2) the cesium salt of the amino acid protected with Boc is kept at 50 ° C in dimethylformamide (DMF); (3) The potassium salt of the Boc-protected amino acid is kept at 80 ° C in dimethyl sulfoxide (DMSO) for 2 hours. Only one milliequivalent of the protected Cys per milliequi-valent Cl on the resin was used.

Verfahren (3) wird unten im Einzelnen beschrieben: zu einem Brei des Harzes und des aufgelösten geschützten Cys in DMSO werden 0,9 mAe Kalium-Butoxid (KOtBut) pro mAe Aminosäure zugegeben. Die Reaktionsmischung wird so wenig wie möglich der Luft ausgesetzt, so dass keine Bernsteinfarbe beobachtet wurde. Eine Reaktion bei 80°C während 2 Stunden ergibt ein geeignetes substituiertes Harz für die Synthese der Peptide (etwa 0,2 Ae Aminosäurederivat pro Harz). Nach der Wegnahme der Schutzgruppe und der Neutralisation wird die Peptidkette auf dem Harz aufgebaut. Die Entfernung der Schutzgruppe, Neutralisation und Zugabe einer jeden Aminosäure wird in Übereinstimmung mit der Aufstellung I ausgeführt. Das Na-t-Butyl-oxycarbonyl (Boc)-Derivat von jeder Aminosäure wird eingesetzt, mit der Ausnahme, dass eine a-Amino-Schutzgruppe für den Alanin 1 Rest verwendet werden kann, vorausgesetzt, dass sie mit HF gespalten wird (Benzyloxycarbonyl, Z; Boc und andere). Nach der Entfernung des ersten Restes (d.h., SpOMe . Bzl . Cys) gemäss Aufstellung I (Stufen 3 bis und mit 8), wird das N Boc-Derivat von Ser zusammen mit dem Verbindungsmittel zugegeben, welches Di-cyclohexylcarbodiimid (DOC) ist (Stufe 8 in der Aufstellung I). Die Seitenkette von Ser wird mit Benzyläther (OBzl) geschützt. Die O-Benzyl-Schutzgruppe (OBzl) wird ebenfalls für den Schutz der Threonin-Seitenkette verwendet. p-Nitrophenylester (ONp) wird eingesetzt, um das Car-boxylende von Asn zu aktivieren. o-Nitrophenylester kann ebenfalls für diesen Zweck gebraucht werden. Formylgrup-pen können für den Schutz der Indol N-H verwendet werden. Benzyloxycarbonyl1 (Z) oder Benzyloxycarbonyl-2Cl [Z (2-CL)] wurden als Schutzgruppe für die Lys-Seiten-kette gebraucht. Method (3) is described in detail below: 0.9 mA of potassium butoxide (KOtBut) per mAe of amino acid are added to a slurry of the resin and the dissolved protected Cys in DMSO. The reaction mixture is exposed to the air as little as possible so that no amber color is observed. Reaction at 80 ° C for 2 hours gives a suitable substituted resin for the synthesis of the peptides (about 0.2 Ae amino acid derivative per resin). After the protective group has been removed and neutralized, the peptide chain is built up on the resin. Deprotection, neutralization and addition of each amino acid is carried out in accordance with Table I. The Na-t-butyloxycarbonyl (Boc) derivative of each amino acid is used, with the exception that an a-amino protecting group can be used for the alanine 1 residue, provided that it is cleaved with HF (benzyloxycarbonyl, Z; Boc and others). After removing the first residue (ie, SpOMe. Bzl. Cys) according to List I (steps 3 to and with 8), the N Boc derivative of Ser is added together with the binding agent, which is di-cyclohexylcarbodiimide (DOC) ( Level 8 in the list I). The side chain from Ser is protected with benzyl ether (OBzl). The O-benzyl protecting group (OBzl) is also used to protect the threonine side chain. p-Nitrophenyl Ester (ONp) is used to activate the car-boxyl end of Asn. o-Nitrophenyl ester can also be used for this purpose. Formyl groups can be used to protect the indole N-H. Benzyloxycarbonyl1 (Z) or benzyloxycarbonyl-2Cl [Z (2-CL)] were used as a protective group for the Lys side chain.

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6 6

1. Aufstellung für die Verknüpfung der Aminosäuren, welche von Asn verschieden sind, in einer Synthese in fester Phase (5-10 g Harz) 1. List for linking the amino acids, which are different from Asn, in a synthesis in solid phase (5-10 g resin)

Stufe step

Reagentien und Arbeitsgänge Reagents and operations

Mischzeilen (Min.) Mixing lines (min.)

1 1

Waschen mit 80 ml CH2C12 (zweimal) Wash with 80 ml CH2C12 (twice)

3 3rd

2 2nd

Waschen mit 30 ml Methanol (MeOH) (zweimal) Wash with 30 ml of methanol (MeOH) (twice)

3 3rd

Waschen mit 80 ml CH2C12 (dreimal) Wash with 80 ml CH2C12 (three times)

3 3rd

4 4th

70 ml 50prozentige Trifluoressigsäure (TFA), welche 5% 1,2-Äthandithiol enthält, in CH2C12 (zweimal) 70 ml of 50 percent trifluoroacetic acid (TFA), which contains 5% 1,2-ethanedithiol, in CH2C12 (twice)

10 10th

5 5

Waschen mit 80 ml CH2C12 (zweimal) Wash with 80 ml CH2C12 (twice)

3 3rd

6 6

70 ml 12,5%iges Triäthylamin (Aet N) in CH2C12 (zweimal) 70 ml 12.5% triethylamine (Aet N) in CH2C12 (twice)

5 5

7 7

Waschen mit 40 ml MeOH (zweimal) Wash with 40 ml MeOH (twice)

2 2nd

8 8th

Waschen mit 80 ml CH2C12 (dreimal) Wash with 80 ml CH2C12 (three times)

3 3rd

9 9

BOC-Aminosäure (10 Mol) in 10 ml DMF (einmal) und 30 ml CH2C12 plus DCC (10 Mol) in CH2C12 (2 m) BOC amino acid (10 moles) in 10 ml DMF (once) and 30 ml CH2C12 plus DCC (10 moles) in CH2C12 (2 m)

30 bis 120 30 to 120

10 10th

Waschen mit 40 ml MeOH (zweimal) Wash with 40 ml MeOH (twice)

3 3rd

11 11

12,5%iges Aet3N in CH2C12 (zweimal) 12.5% Aet3N in CH2C12 (twice)

3 3rd

12 12

Waschen mit 30 ml MeOH (zweimal) Wash with 30 ml MeOH (twice)

3 3rd

13 13

Waschen mit 80 ml CH2C12 (zweimal) Wash with 80 ml CH2C12 (twice)

3 3rd

Nach Stufe 13 wird ein Aliquot für einen Ninhydrin-test gebraucht: After level 13 an aliquot is needed for a ninhydrin test:

ist der Test negativ, geht man auf Stufe 1 zurück, um den Anschluss der nächsten Aminosäure durchzuführen; ist der Test positiv oder leicht positiv, geht man auf die Stufen 9 bis 13 zurück. Aufstellung I wurde verwendet, um jede der Aminosäuren des Peptides mit Ausnahme von Asn (falls vorhanden) an das Cys anzufügen. Falls die erfindungsgemäss hergestellten Peptide Asn enthielten, sind die Stufen 1 bis 8 die gleichen und Aufstellung II wird für den Rest der Verbindungsreaktion gebraucht: if the test is negative, go back to level 1 to connect the next amino acid; if the test is positive or slightly positive, you go back to levels 9 to 13. Panel I was used to add any of the amino acids of the peptide to the Cys except for Asn (if present). If the peptides produced according to the invention contained Asn, stages 1 to 8 are the same and list II is used for the rest of the compound reaction:

II. Aufstellung für Boc-Asn-ONp oder für einen aktiven Ester, welche sich in einer Synthese in fester Phase verbinden (5-10 g Harz) II. List for Boc-Asn-ONp or for an active ester, which combine in a synthesis in solid phase (5-10 g resin)

Stufe step

Reagentien und Arbeitsgänge Reagents and operations

Mischzeiten (Min.) Mixing times (min.)

9 9

Waschen mit 60 ml DMF (dreimal) Wash with 60 ml DMF (three times)

3 3rd

10 10th

Boc-Asn-ONp (15 Mol) in 20 ml DMF (einmal) Boc-Asn-ONp (15 mol) in 20 ml DMF (once)

800 800

11 11

Waschen mit 30 ml MeOH (viermal) Wash with 30 ml MeOH (four times)

3 3rd

12 12

30 ml 12,5%iges Aet3Nin DMF (zweimal) 30 ml 12.5% Aet3Nin DMF (twice)

3 3rd

13 13

Waschen mit 30 ml MeOH (zweimal) Wash with 30 ml MeOH (twice)

3 3rd

14 14

Waschen mit 80 ml CH2C12 (dreimal) Wash with 80 ml CH2C12 (three times)

3 3rd

Nach Stufe 14, wird ein Aliquot für einen Ninhydrin-test gebraucht: After level 14, an aliquot is needed for a ninhydrin test:

ist der Test negativ, geht man auf Stufe 1 für den Anschluss der nächsten Aminosäure zurück; falls der Test positiv oder leicht positiv ist, geht man auf die Stufen 9 bis 14 zurück. if the test is negative, go back to level 1 to connect the next amino acid; if the test is positive or slightly positive, go back to levels 9 to 14.

Die Abspaltung der Peptide vom Harz (5 gr) und die Wegnahme der Seitenketten-Schutzgruppen des Peptides wurde in Flusssäure (75 ml) in Gegenwart von Anisol (8 ml) ausgeführt. Nach der Entfernung der Flusssäure unter Hochvakuum wird das Harz-Peptid mit Äther gewaschen. The cleavage of the peptides from the resin (5 gr) and the removal of the side chain protecting groups of the peptide was carried out in hydrofluoric acid (75 ml) in the presence of anisole (8 ml). After removing the hydrofluoric acid under high vacuum, the resin peptide is washed with ether.

Das getrocknete Harz wird sofort mit 25 %iger Essigsäure (150 ml) extrahiert und mit entgastem H20(N2) auf 3000 ml verdünnt. Der pH der Lösung wurde mit NH4OH auf 6,6-7,0 eingestellt. Die Lösung wurde tropfenweise unter Rühren mit Kaliumferricyanid-Lösung (1 g/500 ml HzO) titriert, bis eine bleibende gelbe Farbe beobachtet werden konnte. Man liess die Lösung während 10 Minuten stehen; der pH wurde mit Eissessig auf 5,0 eingestellt; Bio Rad AG 3-X4A Harz (0,074-0,149 mm, Chloridform, 10-15 g) wurde zur schlämmigen Lösung gegeben und es wurde während 15 Minuten gerührt. Die Lösung wurde über Celite filtriert und nacheinander in zwei Kolonnen gebracht: a) Bio Rad AG 3-X4A Harz Chloridform (10 ml); b) Bio Rex-70 Harz (100 ml), kationische Form. Der Celite- und Harz-Kuchen wurde mit Wasser (500 ml) durch und durch gewaschen, worauf man diesen als Waschflüssigkeit auf die Kolonnen a) und b) brachte. Das Peptidmaterial wurde dann aus einer Bio-Rex-70 Harzkolonne mit Pyridin : Essigsäure : Wasser (30:4:66) oder 50%iger Essigsäure eluiert. Die Fraktionen wurden gesammelt; nur diejenigen, welche Peptid enthielten (Ninhydrid positiv) wurden mit Wasser verdünnt und sofort gefriergetrocknet. 1,2 g eines cremefarbigen Materials wurden erhalten. Dieses wurde auf eine Se-phadex G-25 F Gelkolonne (3 X 200 cm) aufgetragen, ins Gleichgewicht gebracht und mit 2 n Essigsäure eluiert. The dried resin is immediately extracted with 25% acetic acid (150 ml) and diluted to 3000 ml with degassed H20 (N2). The pH of the solution was adjusted to 6.6-7.0 with NH4OH. The solution was titrated dropwise with potassium ferricyanide solution (1 g / 500 ml HzO) while stirring until a permanent yellow color could be observed. The solution was allowed to stand for 10 minutes; pH was adjusted to 5.0 with glacial acetic acid; Bio Rad AG 3-X4A resin (0.074-0.149 mm, chloride form, 10-15 g) was added to the slurry solution and stirred for 15 minutes. The solution was filtered through Celite and successively placed in two columns: a) Bio Rad AG 3-X4A resin chloride form (10 ml); b) Bio Rex-70 resin (100 ml), cationic form. The Celite and resin cake was thoroughly washed with water (500 ml), whereupon it was applied to columns a) and b) as a washing liquid. The peptide material was then eluted from a Bio-Rex-70 resin column with pyridine: acetic acid: water (30: 4: 66) or 50% acetic acid. The fractions were collected; only those containing peptide (ninhydride positive) were diluted with water and immediately freeze-dried. 1.2 g of an off-white material was obtained. This was applied to a Se-phadex G-25 F gel column (3 × 200 cm), brought into equilibrium and eluted with 2N acetic acid.

Die Elutionsproben wurden bei 280 nm beobachtet und zeigten einen symmetrischen Hauptpeak mit dem Zentrum bei 2 V0 (400 mg). Sie wurde anschliessend einer Gegenstromverteilung unterworfen (Lösungsmittelsystem n-Buta-nol : Essigsäure : Wasser, 4:1:5) mit 10ml der unteren Phase pro Röhrchen. 237 Übertragungen wurden ausgeführt; der Hauptpeak wurde in den Röhrchen 48-69 gefunden. Die Verbindung (250 mg) erschien auf dem Dünnschicht-Chromatogramm homogen. The elution samples were observed at 280 nm and showed a symmetrical main peak centered at 2 V0 (400 mg). It was then subjected to a countercurrent distribution (solvent system n-buta-nol: acetic acid: water, 4: 1: 5) with 10 ml of the lower phase per tube. 237 transfers were made; the main peak was found in tubes 48-69. The compound (250 mg) appeared homogeneous on the thin layer chromatogram.

Die spezifische optische Drehung war The specific optical rotation was

[«]D23 = -38,2 ± 1 [«] D23 = -38.2 ± 1

(c = 1 in 1 % Essigsäure). Eine Aminosäureanalyse dieses Materials zeigte das erwartete Verhältnis für verschiedene Aminosäuren. (c = 1 in 1% acetic acid). An amino acid analysis of this material showed the expected ratio for different amino acids.

Aktive Ester können in einer Synthese in fester Phase verwendet werden und es ist ebenfalls möglich, dass die klassischen Synthesemethoden eingesetzt werden, um die erfindungsgemässen Peptide herzustellen. Active esters can be used in a solid phase synthesis and it is also possible that the classic synthesis methods are used to produce the peptides according to the invention.

In vitro Bioanalyse: Die Auswirkungen der verschiedenen erfindungsgemäss herstellbaren neuen Peptide wurden in vitro auf die Sekretion von Wachstumshormonen durch Primärkulturen von enzymatisch dissozierten, vorher schleimabsondernden Rattenzellen nach der Methode von Vale et al., Endocrinology 91: Seiten 562-571 (1972) getestet. Der Versuch wurde so durchgeführt, dass man schleimabsondernde Drüsen, welche aus Ratten entnommen wurden, behandelte, um daraus Zellen abzutrennen. Die Zellen wurden nach einer Modifikation von Dulbecco's modifiziertem Adlermedium in Kulturschüsseln gebracht. (Vale et al., Me-thods in Enzymology). Die Zellkulturen, welche man bei In vitro bioanalysis: The effects of the various new peptides that can be produced according to the invention were tested in vitro on the secretion of growth hormones by primary cultures of enzymatically dissociated, previously mucus-secreting rat cells according to the method of Vale et al., Endocrinology 91: pages 562-571 (1972). The experiment was carried out by treating mucus-secreting glands, which were taken from rats, in order to separate cells therefrom. The cells were placed in culture dishes after modification of Dulbecco's modified eagle medium. (Vale et al., Methods in Enzymology). The cell cultures which one at

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10 10th

15 15

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7 7

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37°C während 4-5 Tagen vor der Verwendung im Versuch aufrechterhält, werden mit Kohlendioxid- und Sauerstoffgas versehen. Nach den Medienwechseln werden die Zellkulturen 4 Stunden lang ausgebrütet und besondere Somatosta-tin-Peptide dazugegeben. Eine Radioimmunprüfungsanalyse wird verwendet, um die Geschwindigkeit der Sekretion von Wachstumshormonen zu bestimmen, welche in Nanogram pro Schüssel pro Stunde ausgedrückt wird. Maintained at 37 ° C for 4-5 days prior to use in the experiment are supplied with carbon dioxide and oxygen gas. After changing the media, the cell cultures are incubated for 4 hours and special somatostatin peptides are added. A radioimmunoassay analysis is used to determine the rate of growth hormone secretion, which is expressed in nanograms per bowl per hour.

Eine Untersuchung in bezug auf die Wirkungen von Somatostatin, Dihydrosomatostatin (als Kontrollen) und der erfindungsgemäss herstellbaren neuen Peptide, welche die Freisetzung von Glucagon und Insulin hemmen, wurde wie folgt durchgeführt: An investigation with respect to the effects of somatostatin, dihydrosomatostatin (as controls) and the novel peptides which can be prepared according to the invention and which inhibit the release of glucagon and insulin was carried out as follows:

In vivo Bioanalyse: Männliche «Sprague-Dawley-CD»-Ratten mit einem Gewicht von 180-200 g wurden in allen Versuchen verwendet, welche in Zellen mit kontrollierter Temperatur und Feuchtigkeit mit 14 Stunden Licht und 14 Stunden Nacht hausten (Licht 0700-21100). Die Tiere wurden mit einer Standardration und Wasser aus dem Hahn ad libitum gefüttert. Die Versuche wurden während mindestens 5 Tagen nach Ankunft der Ratten vom Lieferanten zwischen den Zeiten (14°° und 16°°) ausgeführt. Nach der Ätheranästhesie wurden die Peptide oder Salzlösungen in einem Volumen von 0,2 ml durch die äu„;ere Kehldrosselader verabreicht. Die Tiere blieben bis zu der Zeit anästhetiert, wo das Blut aus der Pfortader gesammelt wurde. Die Blutproben wurden in gekühlte Röhrchen gebracht, welche 10 mg EDTA und 50 vi 2m Benzamidin pro ml Blut enthielten. In vivo bioanalysis: Male Sprague-Dawley-CD rats weighing 180-200 g were used in all experiments which lived in cells with controlled temperature and humidity with 14 hours of light and 14 hours of night (light 0700-21100 ). The animals were fed a standard ration and tap water ad libitum. The experiments were carried out by the supplier between the times (2:00 pm and 4:00 pm) for at least 5 days after the rats' arrival. After ether anesthesia, the peptides or saline solutions were administered in a volume of 0.2 ml through the external throat throttle. The animals remained anesthetized until the blood was collected from the portal vein. The blood samples were placed in chilled tubes containing 10 mg EDTA and 50 vI 2m benzamidine per ml blood.

Das Plasma wurde bei — 20°C für Insulin- und Gluca-gonbestimmungen gelagert. Die Höhe des Insulinspiegels wurde nach der Methode von Herbert et al., J. Chem. The plasma was stored at -20 ° C for insulin and gluca gon determinations. The level of insulin was determined according to the method of Herbert et al., J. Chem.

Endoer. Metab. 25:1375, 1965 bestimmt, wobei Schweinsinsulin-Antisera und mit Jod (1251) versehene Insulintracer verwendet wurden. Menschlicher Insulinstandard wurde von Schwarz-Mann, Orangeburg, New York erhalten. Gluca-5 gon wurde nach der Methode von Faloona und Unger, In Jaffe et al ed., Methoden der Homon Radioimmunoprüfung, Academic Press, New York, 1974, Seite 317 bestimmt, wobei Glucagon-Antisera 30K verwendet wurden. Glucose wurde nach der Methode der Glucose-Oxidase bestimmt, xo wobei ein «Beckman» Glucose Analyzer verwendet wurde. Endoer. Metab. 25: 1375, 1965 using porcine insulin antisera and insulin tracers provided with iodine (1251). Human insulin standard was obtained from Schwarz-Mann, Orangeburg, New York. Gluca-5 gon was determined by the method of Faloona and Unger, In Jaffe et al ed., Methods of Homon Radioimmunoassay, Academic Press, New York, 1974, page 317, using Glucagon Antisera 30K. Glucose was determined using the glucose oxidase method, xo using a “Beckman” glucose analyzer.

Bestimmungen von Wachstumshormonen wurden auf Medien von Gewebekulturen ausgeführt, wobei die folgenden Reagentien verwendet wurden: NIAMDD Ratten-Wachstumshormon-Standard (GH-RP-1), NIAMID Affen Antirat-15 ten Wachstumshormon (GH-Serum-3), und sehr gut gereinigtes Rattenwachstumshormon für Jodierung. Growth hormone determinations were carried out on tissue culture media using the following reagents: NIAMDD rat growth hormone standard (GH-RP-1), NIAMID monkey anti-15th growth hormone (GH-Serum-3), and very well purified Rat growth hormone for iodination.

Alle Versuche wurden in einer zufälligen Blockanordnung ausgeführt. Die folgende Analyse der Varianz zwischen den Behandlungen wurde mit Hilfe der Vielbereichs-20 tests von Dunnett and Duncan bestimmt. Die Werte der Wirksamkeit wurden aus vier bis sechs Punkt Bioanalysen berechnet. All experiments were carried out in a random block arrangement. The following analysis of variance between treatments was determined using the Dunnett and Duncan multi-range 20 tests. Efficacy values were calculated from four to six point bioanalyses.

Verschiedene neue Peptide wurden in Übereinstimmung mit den oben beschriebenen Verfahren in fester Phase her-25 gestellt. Die Zusammensetzung der Peptide ist in der folgenden Tabelle I wiedergegeben. In Tabelle I ist ebenfalls das Verhältnis in bezug auf die Wirksamkeit des Peptides bei der Eindämmung der Sekretion von Wachstumshormonen, Insulin und Glucagon gezeigt, wobei die Hemmung von 30 Glucagon als Grundlage dient. In Tabelle I ist ferner die prozentuale Wirksamkeit des Peptides im Hinblick auf die Reduktion der Hormone mit Somatostatin ausgeführt, wobei dieses als 100% wirksam betrachtet wird. Various new peptides were made in solid phase in accordance with the procedures described above. The composition of the peptides is shown in Table I below. Table I also shows the ratio of the effectiveness of the peptide in containing growth hormone, insulin and glucagon secretion, based on the inhibition of 30 glucagon. Table I also shows the percent effectiveness of the peptide in reducing hormones with somatostatin, which is considered 100% effective.

TABELLE I TABLE I

Somatostatin Verhältnis der Wirksamkeit [<x]D prozentuale Wirksamkeit der Somatostatin ratio of effectiveness [<x] D percentage effectiveness of

(Kontrolle) Wachstumshormon : Insulin : Wachstumshormone, Basis 100 (Control) growth hormone: insulin: growth hormones, base 100

Glucagon 1:1:1 Glucagon 1: 1: 1

[D-Ser13]-SS [D-Ser13] -SS

10 10th

1 1

-34,2° -34.2 °

10 10th

[D-Trp8] - [D-Ser13] -SS [D-Trp8] - [D-Ser13] -SS

18 18th

261 261

<1 <1

-21,9° -21.9 °

[D-Cys14]-SS [D-Cys14] -SS

2,7 2.7

1 1

-19,5° -19.5 °

270 270

[D-Trp8] -SS- [D-Cys14] -SS [D-Trp8] -SS- [D-Cys14] -SS

0,7 0.7

0,13 0.13

1 1

-33,6° -33.6 °

650 650

[D-Cys3] - [D-Ser13] -SS [D-Cys3] - [D-Ser13] -SS

7 7

<1 <1

-38,5° -38.5 °

[D-Cys3] - [D-Cys14] -SS [D-Cys3] - [D-Cys14] -SS

-11,9° -11.9 °

v v

Claims

640827

1. Process for the preparation of new peptides with pharmaceutical utility of formula II

H-AIa-Gly-X-Lys-XrPhe-Phe-X2-Lys-Thr-Phe-Thr-X3-X4

(II)

and the non-toxic salts thereof,

characterized in that a peptide intermediate of formula III

R-Ala-Gly-X- (R1) -Lys (R2) - (X1) -Phe-Phe- (X2) -Lys (R3) -Thr- (R4) -Phe-Thr (R5) - (Xg) - (R6) - (X4) - (R7) - (X5) (III)

forms what

X is selected from Cys and D-Cys;

Xj is selected from Asn and Des-Asn;

X2 is selected from Trp and D-Trp;

X3 is selected from Ser and D-Ser; and

X4 is selected from Cys and D-Cys,

with the proviso that at least one of the groups X3

and X4 represents D-Ser or D-Cys;

R is selected from the class consisting of H and an alpha-amino protecting group;

R1 and R7 are selected from the group consisting of H and a protecting group for Cys selected from S-p-methoxybenzyl, S-p-methylbenzyl, S-acetamidomethyl, S-trityl and S-benzyl;

R2 and R3 are selected from the group consisting of

H and a side chain amino protecting group;

R4, R5 and R6 are selected from the group consisting of H and a hydroxyl protecting group selected from the group consisting of acetyl, benzoyl, tert-butyl, benzyl and benzyloxycarbonyl;

with the further proviso that at least one of the radicals R, R1, R2, R3, R4, R5, R6 and R7 has a different meaning than hydrogen; and

X5 is selected from the group consisting of hydroxy, esters, amides, hydrazides, -0-CH2-polystyrene resin carriers and 0-CH2-benzyl-polystyrene resin carriers, the protective group or the protective groups from the intermediate compound of the formula III cleaves off, and, if X5 represents a resin support, cleaves the peptide from the resin, and optionally produces the non-toxic salts from the compounds obtained.

2. Process for the preparation of new peptides with pharmaceutical utility of formula I.

H-Ala-Gly-X-Lys-XrPhe-Phe-X2-Lys-Thr-Phe-Thr-X3-I

X4 (I)

wherein the substituents are defined in claim 1, and the non-toxic salts thereof, characterized in that peptides of the formula II are prepared in accordance with the process according to claim 1 and then the peptides are oxidized to form a disulfide bond between the Cys residues mentioned to produce, and optionally the compounds thus obtained, the non-toxic salts.

2nd

PATENT CLAIMS

3. The method according to claim 1, characterized in that X has the meaning of Cys, X1 means Asn, X2 means Trp, X3 means Ser and X4 means D-Cys.

4. The method according to claim 1, characterized in that X has the meaning of Cys, Xt means Asn, X2 means D-Trp, X3 means Ser and X4 means D-Cys.

5. The method according to claim 1, characterized in that X has the meaning of Cys, X1 means Asn, X2 means Trp, X3 means D-Ser, and X4 means Cys.

6. The method according to claim 1, characterized in that X has the meaning of Cys, X! means Asn,

X2 means D-Trp, X3 means D-Ser, and X4 means Cys. •

7. The method according to claim 1, characterized in that X5 has the meaning of -0-CH2-polystyrene resin carrier.

8. The method according to claim 7, characterized in that R has the meaning of t-butyloxycarbonyl, R4, R5 and R6 mean benzyl, R2 and R3 mean 2-chloro-benzyloxycarbonyl and R1 and R7 mean S-p-methoxy-benzyl.