BR112021005169A2

BR112021005169A2 - um anticorpo anti-ox40, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e uso farmacêutico

Info

Publication number: BR112021005169A2
Application number: BR112021005169-4A
Authority: BR
Inventors: Cheng Liao; Zupeng Xu; Jiahua JIANG; Xin Ye; Lianshan Zhang
Original assignee: Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd.
Priority date: 2018-09-26
Filing date: 2019-09-25
Publication date: 2021-06-15
Also published as: KR20210069058A; TW202035455A; EP3858857A1; WO2020063660A1; CN112513088B; US20210355229A1; CN112513088A; JP2022502417A; US12227583B2; AU2019347934A1; CA3113541A1; MX2021003168A

Abstract

um anticorpo anti-ox40, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo e uso farmacêutico. a presente invenção fornece um anticorpo anti-ox40, um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e o uso farmacêutico. além disso, o presente pedido fornece um anticorpo quimérico e um anticorpo humanizado, o anticorpo quimérico e o anticorpo humanizado compreendendo uma região de cdr a partir do anticorpo anti-ox40 e o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e também fornece uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo anti-ox40 e o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e o uso do mesmo como um fármaco para tratar cânceres.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “UM ANTICORPO ANTI-OX40, FRAGMENTO DE LIGAÇÃO AO ANTÍGENO DO MESMO E USO FARMACÊUTICO”

[001] Este pedido reivindica as prioridades do documento nº 201811128669.3 depositado em 26 de setembro de 2018 e do documento nº 201811417666.1 depositado em 26 de novembro de 2018.

Campo da Invenção

[002] A presente invenção pertence ao campo da biomedicina e se refere a um anticorpo anti-OX40, fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, um anticorpo quimérico, um anticorpo humanizado que compreende as regiões de CDR do anticorpo anti-OX40, e uma composição farmacêutica que compreende o anticorpo anti-OX40 e fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, e o uso do mesmo como um agente anticâncer.

Fundamentos da Invenção

[003] O câncer é um grave desafio à saúde enfrentado pela sociedade humana há muito tempo. Para tumores sólidos que se espalharam, a cirurgia, quimioterapia e radioterapia tradicionais geralmente exibem efeito limitado.

[004] A imunoterapia tumoral é continuamente um ponto conturbador no campo da terapia tumoral. Estudos recentes provaram que o aumento da função das células T antitumorais pode ser usado para neutralizar o câncer. Há muitas evidências que mostram que as células tumorais “escapam” do sistema imunológico induzindo tolerância imunológica ativa mediada principalmente por linfócitos T reguladores (Treg; Quezda et al. Immunol Rev 2011; 241:104 a 118). Portanto, o equilíbrio entre os linfócitos T efetores (Teff) e as Treg tolerogênicas é essencial para uma imunoterapia antitumoral eficaz. Portanto, uma resposta imune antitumoral eficaz pode ser obtida aumentando a função efetora de Teff específico de tumor e/ou reduzindo a função inibitória de Treg específico de tumor.

[005] O receptor CD134 (OX40) demonstrou ser um receptor chave que medeia essas respostas (Sugamura, K, Ishii, N, Weinberg, A. Therapeutic targeting of the effector T-cell co-stimulatory molecule OX40. Imm 2004; 4:420 a 431)).

[006] OX40 é um membro da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (TNFR) e é uma glicoproteína com peso molecular de cerca de 50 kDa expressa na superfície celular. O domínio de ligação do ligante extracelular de OX40 consiste em 4 domínios ricos em cisteína (CRD). O ligante natural de OX40 é OX40L (CD252), OX40 e OX40L formam um complexo OX40-OX40L.

[007] OX40 é expresso principalmente em células T ativadas e OX40 é uma molécula coestimuladora secundária que é expressa 24 a 72 horas após a ativação. OX40L, um ligante de OX40, é expresso principalmente em células apresentadoras de antígeno ativadas. Foi confirmada a existência de linfócitos T que expressam OX40 nos linfonodos de drenagem de pacientes com vários tumores malignos humanos e cânceres.

Em um modelo de camundongo de imunodeficiência combinada grave (SCID), a interação dos domínios de ligação OX40 e OX40L pode aumentar a imunidade antitumoral, resultando na inibição do crescimento do tumor de várias linhas de células de tumor maligno humano, como linfoma, câncer de próstata, câncer de cólon e câncer de mama.

[008] Atualmente, muitas empresas farmacêuticas internacionais estão desenvolvendo anticorpos monoclonais contra OX40. Os anticorpos OX40 ativam a imunidade por meio de estimulação específica, melhoram a resposta do próprio sistema imunológico do paciente aos tumores e alcançam o objetivo de matar células tumorais. Patentes relacionadas são tais como nº WO2013038191, WO2015153513, WO2016179517, WO2017096182, CN110078825A, WO2016196228 e assim por diante.

Até agora, os anticorpos anti-OX40 desenvolvidos por empresas como AstraZeneca e BMS estiveram em testes clínicos de fase II, e produtos relacionados de empresas como Genentech e GSK também estiveram em testes clínicos.

[009] Entretanto, existe ainda a necessidade de aperfeiçoamento dos medicamentos anteriores em termos de efeitos terapêuticos. Portanto, é necessário desenvolver ainda mais anticorpos anti-OX40 com alta seletividade, alta afinidade e eficácia favorável.

Sumário da Invenção

[0010] A presente divulgação fornece um anticorpo anti- OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, que se liga especificamente a OX40 humano, e compreende as CDRs mostradas abaixo: (i) cadeia pesada HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 3, 4 e 5 respectivamente; ou variantes de HCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença (ou diferenças) de aminoácidos quando comparadas com HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 3, 4 e 5 respectivamente; e/ou cadeia leve LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 6, 7 e 8 respectivamente; ou variantes de LCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença (ou diferenças) de aminoácidos quando comparadas com LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 6, 7 e 8 respectivamente; em particular, cadeia pesada HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 3, 4 e 5 respectivamente, e cadeia leve LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 6, 7 e 8 respectivamente; ou (ii) cadeia pesada HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 11, 12 e 13 respectivamente; ou variantes de HCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença (ou diferenças) de aminoácidos quando comparadas com HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 11, 12 e 13 respectivamente; e/ou cadeia leve LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ

ID NO: 14, 15 e 16 respectivamente; ou variantes de LCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença (ou diferenças) de aminoácidos quando comparadas com LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em

SEQ ID NO: 14, 15 e 16 respectivamente;

em particular, cadeia pesada HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 11, 12 e 13 respectivamente, e cadeia leve LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 14, 15 e 16 respectivamente; ou

(iii) cadeia pesada HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 11, 33 e 13 respectivamente; ou variantes de

HCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença (ou diferenças) de aminoácidos quando comparadas com HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em

SEQ ID NO: 11, 33 e 13 respectivamente; e/ou cadeia leve LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ

SEQ ID NO: 14, 15 e 16 respectivamente;

em particular, cadeia pesada HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 11, 33 e 13 respectivamente, e cadeia leve LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 14, 15 e 16 respectivamente; ou

(iv) cadeia pesada HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 11, 34 e 13 respectivamente; ou variantes de

HCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença (ou diferenças) de aminoácidos quando comparadas com HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 11, 34 e 13 respectivamente; e/ou cadeia leve LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 14, 15 e 16 respectivamente; ou variantes de LCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença (ou diferenças) de aminoácidos quando comparadas com LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 14, 15 e 16 respectivamente; em particular, cadeia pesada HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 11, 34 e 13 respectivamente, e cadeia leve LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 14, 15 e 16 respectivamente.

[0011] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é um anticorpo murino, anticorpo quimérico, anticorpo humanizado, anticorpo humano ou fragmento do mesmo; em particular, um anticorpo humanizado.

[0012] Em algumas modalidades, as CDRs (compreendendo 3 CDRs de cadeia pesada e 3 CDRs de cadeia leve) do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno podem compreender 3, 2 ou 1 diferença (ou diferenças) de aminoácidos (isto é, variantes de CDR). As variantes de CDR são obtidas pelo método de maturação de afinidade.

[0013] Em algumas modalidades, a afinidade (KD) do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno para OX40 é inferior a 10-8 M, inferior a 10-9 M, ou inferior a 10-10 M.

[0014] Em algumas modalidades, o anticorpo murino compreende uma região variável de cadeia pesada e uma região variável de cadeia leve como mostrado abaixo: (i) a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada é como mostrado em SEQ ID NO:1; ou tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO:1; e/ou a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve é como mostrado em SEQ ID NO:2; ou tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO:2; (ii) a sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada é como mostrado em SEQ ID NO:9; ou tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO:9; e/ou a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve é como mostrado em SEQ ID NO:10; ou tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO:10.

[0015] Em algumas modalidades, o anticorpo humanizado compreende região de FR (ou regiões de FR) derivada de linhagem germinativa humana ou sequência mutante (ou sequências mutantes) da mesma.

[0016] Em algumas modalidades, em que o anticorpo humanizado compreende qualquer uma da: (i) uma região variável de cadeia pesada, que é como mostrado em qualquer uma das SEQ ID NO: 17, 18, 31 ou 32; ou tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 17, 18, 31 ou 32; ou (ii) uma região variável de cadeia pesada, que é como mostrado em qualquer uma das SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29 ou 30; ou tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos

92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29 ou

30.

Em uma modalidade, o anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (i) uma região variável de cadeia leve, que é como mostrado em SEQ ID NO: 19 ou 20; ou tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 19 ou 20; ou (ii) uma região variável de cadeia leve, que é como mostrado em qualquer uma das SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 ou 25; ou tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 ou

25.

[0017] Em algumas modalidades particulares, o anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: (i) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em qualquer uma das SEQ ID NO: 17, 18, 31 e 32 e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 19 ou 20; ou (ii) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em qualquer uma das SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29 e 30 e uma região variável de cadeia leve como mostrado em qualquer uma das SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 e 25.

[0018] Em algumas modalidades particulares, o anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende regiões variáveis como mostrado abaixo: (1) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 17, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 19; (2) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 18, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 19; (3) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 31, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 19; (4) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 32, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 19; (5) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 17, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 20;

(6) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 18, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 20; (7) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 31, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 20; ou (8) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 32, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 20.

[0019] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende regiões variáveis como mostrado abaixo: (1) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 26, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 21; (2) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 26, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 22; (3) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 26, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 23; (4) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 26, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 24; (5) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 26, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 25;

(6) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 27, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 21;

(7) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 27, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 22;

(8) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 27, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 23;

(9) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 27, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 24;

(10) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 27, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 25;

(11) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 28, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 21;

(12) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 28, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 22;

(13) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 28, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 23;

(14) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 28, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 24;

(15) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 28, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 25;

(16) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 29, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 21;

(17) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 29, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 22;

(18) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 29, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 23;

(19) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 29, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 24;

(20) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 29, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 25;

(21) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 30, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 21;

(22) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 30, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 22; (23) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 30, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 23; (24) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 30, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 24; e (25) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 30, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 25.

[0020] Em algumas modalidades, o anticorpo anti-OX40 compreende uma região constante; em algumas modalidades particulares, o anticorpo é um anticorpo quimérico ou um anticorpo humanizado, e a região constante de cadeia pesada do anticorpo é derivada de IgG1, IgG2, IgG3, ou IgG4 humana ou da sequência mutante (ou sequências mutantes) dos mesmos, a região constante de cadeia leve é derivada de cadeia kappa, lambda humana ou da sequência mutante (ou sequências mutantes) dos mesmos; em outras modalidades particulares, a sequência de aminoácido da região constante de cadeia pesada é como mostrado em SEQ ID NO: 35 ou tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos

94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 35; a sequência de aminoácido da região constante de cadeia leve é como mostrado em SEQ ID NO: 36 ou tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 36.

[0021] Em algumas modalidades, a sequência de aminoácido de cadeia pesada do anticorpo anti-OX40 é como mostrado em SEQ ID NO: 39 ou 37 ou tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 39 ou 37, e/ou, a sequência de aminoácido de cadeia leve do anti-OX40 é como mostrado em SEQ ID NO: 40 ou 38 ou tem pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 40 ou 38.

[0022] Em uma modalidade, o anticorpo anti-OX40 compreende:

(i) uma cadeia pesada, a sequência de aminoácido da qual é como mostrado em SEQ ID NO: 37 ou tem pelo menos 85% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 37, e uma cadeia leve, a sequência de aminoácido da qual é como mostrado em SEQ ID NO: 38 ou tem pelo menos 85% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 38; ou (ii) uma cadeia pesada, a sequência de aminoácido da qual é como mostrado em SEQ ID NO: 39 ou tem pelo menos 85% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 39, e uma cadeia leve, a sequência de aminoácido da qual é como mostrado em SEQ ID NO: 40 ou tem pelo menos 85% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 40.

[0023] A presente divulgação também fornece um anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, o anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compete com qualquer anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito acima pela ligação ao OX40 humano, ou compete com qualquer anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito acima pela ligação ao mesmo epítopo OX40.

[0024] A presente divulgação também fornece uma composição farmacêutica, que compreende: - uma quantidade terapeuticamente/preventivamente eficaz do anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito acima, e

- um ou mais portadores, diluentes, tampões ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

[0025] Em algumas modalidades particulares, a composição farmacêutica pode ser preparada em uma forma de dose unitária, e a dose unitária pode compreender 0,01 a 99% em peso do anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; ou a quantidade do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreendida na composição farmacêutica é de 0,1 a 2.000 mg/dose unitária.

Em algumas modalidades particulares, a quantidade do anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é de 1 a 1.000 mg.

[0026] Em algumas modalidades particulares, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser o único ingrediente ativo compreendido na composição; em outras modalidades particulares, o anticorpo monoclonal ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é usado em combinação com outros ingredientes ativos.

[0027] A presente divulgação também fornece uma molécula de ácido nucleico isolada, que codifica o anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito acima. No contexto aqui, a sequência complementar da molécula de ácido nucleico também está incluída no escopo deste pedido.

[0028] A presente divulgação também fornece um vetor compreendendo a molécula de ácido nucleico descrita acima.

O vetor pode ser um vetor de expressão eucariótica, um vetor de expressão procariótica ou um vetor viral.

[0029] A presente divulgação também fornece uma célula hospedeira transformada com o vetor descrito acima, e a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em células procarióticas e células eucarióticas.

[0030] Em algumas modalidades particulares, a célula hospedeira é uma célula eucariótica. Em algumas modalidades particulares, a célula hospedeira é uma célula de mamífero, em que a célula de mamífero compreende mas não se limita a CHO, HEK293, e NSO. Deve ser entendido que a célula hospedeira da presente divulgação não envolve qualquer célula capaz de desenvolvimento em seres humanos.

[0031] A presente divulgação também fornece um método para preparar o anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito acima, o método compreende: - cultivar a célula hospedeira descrita acima; - recuperar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; - opcionalmente, purificar o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[0032] A presente divulgação também fornece um método para detectar ou medir OX40 humano, o método compreende: - contatar o anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo como descrito acima com uma amostra (por exemplo, de ser humano); - opcionalmente, determinar a quantidade de OX40 na amostra, ou determinar se OX40 está presente ou não.

[0033] A presente divulgação também fornece um reagente para detectar ou medir OX40 humano, o reagente compreende qualquer um dos anticorpos anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito acima.

[0034] A presente divulgação também fornece um agente de diagnóstico para doenças relacionadas a OX40 humano, o agente de diagnóstico compreende o anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito acima.

[0035] A presente divulgação também fornece um método para diagnosticar doenças relacionadas a OX40 humano, o método compreende detectar ou medir Células OX40 ou OX40 positivas humanas usando o anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito acima.

[0036] A presente divulgação também fornece o uso do anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo na preparação de um agente de diagnóstico para doenças relacionadas a OX40 humano.

[0037] A presente divulgação também fornece um método para tratar doença ou distúrbio, que compreende administrar a um indivíduo uma quantidade eficaz do anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, ou uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo OX40 ou fragmento do mesmo descrito acima.

[0038] Em algumas modalidades, a doença ou distúrbio pode ser câncer ou doença proliferativa celular. Em algumas modalidades particulares, o câncer é câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço, câncer esofágico, carcinoma gástrico, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer de bexiga, câncer cervical, câncer uterino, câncer ovariano, câncer de fígado, melanoma, câncer de rim, carcinoma de células escamosas, câncer hematológico ou qualquer outra doença ou distúrbio caracterizado pelo crescimento celular descontrolado.

[0039] Em algumas modalidades particulares, o câncer hematológico compreende mas não é limitado a leucemia mielógena crônica e aguda, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crônica, doença proliferativa de tecido de medula óssea, mieloma múltiplo, doença de Hodgkin, linfoma de Não Hodgkin, linfoma de célula B, linfoma de célula T, linfoma de célula do centro folicular e leucemia mieloide crônica.

[0040] A presente divulgação também fornece o uso do anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito acima, ou a composição farmacêutica compreendendo o anticorpo OX40 ou fragmento do mesmo descrito acima, na preparação de um medicamento para aumentar a resposta imune em um indivíduo humano.

[0041] A presente divulgação também fornece o uso do anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito acima, ou a composição farmacêutica compreendendo o anticorpo OX40 ou fragmento do mesmo descrito acima, na preparação de um medicamento para o tratamento/prevenção de câncer.

[0042] A presente divulgação também fornece o uso do anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo descrito acima, ou a composição farmacêutica compreendendo o anticorpo OX40 ou fragmento do mesmo descrito acima, na preparação de um kit.

[0043] Em algumas modalidades, a resposta imune aumentada compreende um aumento na função imunoestimuladora/efetora de células efetoras T, e/ou uma regulação para baixo da função imunossupressora de células reguladoras T. Em que, o aumento pode ser o resultado de proliferação celular, e a regulação para baixo pode ser o resultado da ausência de aumento no número de célula (ou diminuição no número de célula).

[0044] A presente divulgação fornece o anticorpo anti- OX40 humano ou fragmento do mesmo para o uso em um ou mais dos seguintes: inibir a função Treg (por exemplo, inibir a função supressora de Treg), matar células que expressam OX40 (por exemplo, células que expressam alto nível de OX40),

melhorando a função das células T efetoras e/ou melhorando a função das células T de memória, reduzindo a imunidade do tumor, aumentando a função das células T e/ou reduzindo as células que expressam OX40.

[0045] A presente divulgação fornece o uso do anticorpo anti-OX40 ou fragmento do mesmo para o seguinte: tratamento de câncer, estimulação da resposta imune em um indivíduo, estimulação da resposta de célula T específica para antígeno, ativação ou coestimulação de células T, aumento de citocinas produção em células T (como IL-2 e/ou IFN-γ) e/ou aumento da proliferação de células T, redução ou depleção do número de células T reguladoras no tumor e/ou inibição do crescimento de células tumorais.

[0046] A presente divulgação também fornece o uso do anticorpo anti-OX40 na preparação de um agente, o agente é para uso na estimulação da resposta imune em um indivíduo, estimulação da resposta de célula T específica do antígeno, ativação ou coestimulação de células T, aumentando a produção de IL-2 e/ou IFN-γ em células T e/ou proliferação de células T, reduzindo ou esgotando o número de células T reguladoras no tumor e/ou inibindo o crescimento de células tumorais.

Descrição dos Desenhos

[0047] A Figura 1A a Figura 1B: resultados do teste ELISA mostrando a afinidade do anticorpo murino e anticorpo quimérico para OX40 humano. A Figura 1A mostra o resultado da afinidade do anticorpo murino m2G3 e do anticorpo quimérico ch2G3, com m2G3-NC e ch2G3-NC como controles negativos; A Figura 1B mostra o resultado da afinidade do anticorpo murino m4B5 e do anticorpo quimérico ch4B5, com m4B5-NC e ch4B5-NC como controles negativos.

[0048] Figura 2: Teste mostrando o IFN-γ secretado em células T estimuladas por anticorpo anti-OX40. Os resultados mostram que o anticorpo OX40 de teste atinge o efeito estimulante máximo a uma concentração de 10 ng/ml.

[0049] A Figura 3A a Figura 3B: efeito antitumoral do anticorpo anti-OX40 em camundongos. A Figura 3A mostra as mudanças no volume do tumor em diferentes camundongos após a administração; A Figura 3B mostra o efeito de diferentes anticorpos anti-OX40 no peso do tumor em camundongos após a administração. Os resultados mostram que no dia 20 após a dosagem do tratamento, quando a dose é de 3 mg/kg, a taxa de inibição tumoral do anticorpo 2G3 é de até 97%.

Terminologia

[0050] De modo a fazer com que a presente divulgação seja mais facilmente compreendida, certos termos técnicos e científicos são definidos especificamente abaixo. A menos que especificamente definido em outro lugar neste documento, todos os outros termos técnicos e científicos usados neste documento têm o significado comumente entendido por uma pessoa de habilidade comum na técnica ao qual o presente pedido se refere.

[0051] O termo “intensificar a função das células T” significa induzir, causar ou estimular células T efetoras ou de memória, de modo que tenham funções biológicas de renovação, sustentadas ou amplificadas. Exemplos de função de célula T melhorada incluem: secreção aumentada de interferon γ de células T efetoras CD8+, secreção aumentada de interferon γ de células T de memória e/ou efetoras CD4+, proliferação aumentada de células T efetoras de CD4+ e/ou de memória, aumento proliferação de células T efetoras CD8+ e aumento da resposta ao antígeno (por exemplo, eliminação), quando comparado com o nível antes do tratamento.

[0052] O termo “aumento da resposta imunológica” refere-se a estimular, irritar, aumentar, melhorar ou intensificar a resposta do sistema imunológico em mamíferos.

A resposta imune pode ser uma resposta celular (isto é, mediada por células, como mediada por linfócitos T citotóxicos) ou uma resposta humoral (isto é, resposta mediada por anticorpos) e pode ser a resposta imune primária ou secundária. Exemplos de resposta imune aumentada incluem: atividade aumentada de células T auxiliares CD4+ e produção de células T citotóxicas. A resposta imune aumentada pode ser avaliada por algumas medições in vivo ou in vivo conhecidas pelas pessoas versadas na técnica, compreendendo, mas não se limitando a, ensaio de linfócitos T citotóxicos,

liberação de citocinas (como produção de IL-2), regressão do tumor e sobrevivência de animais portadores de tumor, produção de anticorpos, proliferação de células imunes, expressão de marcador de superfície celular e citotoxicidade. Em uma modalidade, o método aumenta a resposta imune celular, particularmente a resposta de células T citotóxicas.

[0053] “Imunidade tumoral” refere-se ao processo pelo qual os tumores escapam do reconhecimento e eliminação imunológica. Como conceito de tratamento, o tumor será reconhecido e atacado pelo sistema imunológico e, consequentemente, o paciente será tratado, quando a imunidade do tumor estiver enfraquecida em sua capacidade de escapar do reconhecimento e eliminação imunológica. Exemplos de reconhecimento de tumor incluem ligação ao tumor, redução do tumor e eliminação do tumor.

[0054] “Células efetoras T” (“Teffs”) referem-se a células T com atividade citolítica (por exemplo, células CD4+ e CD8+) e células T auxiliares (Th). Os teffs secretam citocinas e ativam e orientam as células do sistema imunológico que não as células T regulatórias (células Treg).

Os anticorpos anti-OX40 descritos na presente divulgação podem ativar células Teff, como células Teff CD4+ e CD8+.

[0055] “Células T reguladoras” ou “células Treg” significam um tipo especializado de células T CD4+ que podem suprimir a resposta de outras células T. As células Treg são caracterizadas por expressar CD4, subunidade α do receptor de IL-2 (CD25) e o fator de transcrição forkhead box P3 (FOXP3) (Sakaguchi, Annu Rev Immunol 22, 531-62 (2004)) e desempenham um papel vital na indução e manutenção da tolerância autóloga periférica. Os alvos de tolerância contra antígenos expressos por tumores.

[0056] “OX40” refere-se a um receptor que se liga ao ligante OX40 (OX40-L) e é um membro da superfamília do receptor de TNF. OX40 também é conhecido como membro 4 da superfamília do receptor do fator de necrose tumoral (TNFRSF4), ACT35, IMD16, TXGP1L e CD134. O termo “OX40” inclui qualquer variante ou isotipo de OX40 que é naturalmente expresso por uma célula. Portanto, os anticorpos OX40 ou fragmento dos mesmos descritos na presente divulgação podem apresentar reação cruzada com OX40 de outras espécies que não humanos (por exemplo, macaco cynomolgus OX40). Alternativamente, os anticorpos OX40 ou fragmento dos mesmos podem ser específicos para OX40 humano e não exibem reatividade cruzada com OX40 de outras espécies.

[0057] OX40 ou variante e isoforma do mesmo é isolado de células ou tecidos nos quais é naturalmente expresso ou produzido de forma recombinante usando técnicas bem conhecidas na técnica e/ou na presente divulgação. A menos que especificado de outra forma, “OX40” pode ser OX40 natural derivado de qualquer fonte de vertebrados, compreendendo mamíferos como primatas (por exemplo, seres humanos) e roedores (por exemplo, camundongos e ratos). O termo abrange “comprimento total”, OX40 não processado e quaisquer formas de OX40 devido ao processamento ocorrido dentro de uma célula. O termo também cobre variantes de ocorrência natural de OX40, como variantes de splicing ou variantes alélicas.

[0058] “Ativação OX40” refere-se à ativação do receptor OX40. Geralmente, a ativação do OX40 leva à sinalização.

[0059] Um “anticorpo anti-OX40” ou “um anticorpo que se liga a OX40” refere-se a um anticorpo que pode se ligar a OX40 com afinidade suficiente para que o anticorpo possa ser usado como um agente de diagnóstico e/ou terapêutico para direcionar OX40.

[0060] O termo “redução das células que expressam OX40” significa que o anticorpo anti-OX40 ou fragmento do mesmo mata ou elimina células que expressam OX40. A redução das células que expressam OX40 pode ser alcançada por meio de vários mecanismos, como citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos (ADCC) e/ou fagocitose.

[0061] O termo “citocina” é um termo geral para um tipo de proteínas que são liberadas por uma população de células, e as citocinas atuam como mediadores intercelulares atuando em outra célula. Exemplos de tais citocinas são linfoquinas, monócitos; interleucinas (ILs), como IL-1, IL-1α, IL-2, IL-

3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-11, IL-12, IL-15; fatores de necrose tumoral, tais como TNF-α ou TNF-β; e outros fatores polipeptídicos, compreendendo LIF e ligante de kit (KL) e interferon γ. Conforme usado na presente divulgação, o termo citocinas envolve proteínas de fontes naturais ou de cultura de células recombinantes e equivalentes biologicamente ativos dos mesmos, compreendendo pequenas entidades moleculares produzidas por síntese artificial e derivados e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

[0062] Como usado na presente divulgação, o código de três letras e o código de uma única letra para aminoácidos são conforme descrito em J. Biol. Chem, 243, página 3558 (1968).

[0063] O termo “anticorpo” não é limitado por qualquer método específico para a produção de anticorpos. Por exemplo, envolve anticorpos recombinantes, anticorpos monoclonais e anticorpos policlonais. Os anticorpos podem ser anticorpos de diferentes isotipos, por exemplo, anticorpos IgG (por exemplo, subtipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE ou IgM.

[0064] Perto do terminal N da cadeia pesada e da cadeia leve do anticorpo, uma sequência de cerca de 110 aminoácidos varia amplamente, conhecida como região variável (região V); o resto da sequência de aminoácidos perto do terminal C é relativamente estável, conhecido como região constante (região C). A região variável compreende três regiões hipervariáveis (HVRs) e quatro regiões de framework (FRs) com sequência relativamente conservada. As três regiões hipervariáveis determinam a especificidade do anticorpo, também conhecidas como regiões determinantes de complementaridade (CDRs). Cada região variável da cadeia leve (VL) e cada região variável da cadeia pesada (VH) é composta por três CDRs e quatro FRs, com uma ordem do terminal amino para o terminal carboxila sendo: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. Três CDRs de cadeia leve referem- se a LCDR1, LCDR2 e LCDR3; três CDRs de cadeia pesada referem-se a HCDR1, HCDR2 e HCDR3.

[0065] O número e a posição dos resíduos de aminoácidos de CDR na região LCVR e região HCVR do anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno descrito na presente divulgação estão em conformidade com os critérios de numeração de Kabat conhecidos (para LCDR1-3, HCDR1-3).

[0066] O termo “anticorpo humano recombinante” inclui anticorpos humanos preparados, expressos, criados ou isolados por método recombinante e as técnicas e métodos envolvidos são bem conhecidos na técnica, tais como: (1) anticorpos isolados de animais transgênicos do gene da imunoglobulina humana ou animais transcromossômicos (por exemplo, camundongos), ou hibridoma preparado a partir dos mesmos; (2) anticorpos isolados de células hospedeiras transformadas que expressam os anticorpos, tais como transfectoma; (3) anticorpos isolados de uma biblioteca combinatória de anticorpo humano recombinante; e (4) anticorpos preparados, expressos, criados ou isolados por splicing da sequência do gene da imunoglobulina humana a outras sequências de DNA ou semelhantes. Esses anticorpos humanos recombinantes compreendem regiões variáveis e regiões constantes, que envolvem sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana específicas codificadas por genes da linha germinativa, mas também envolvem rearranjos e mutações subsequentes, como aquelas ocorridas durante a maturação do anticorpo.

[0067] Os anticorpos da presente divulgação referem-se a anticorpos murinos, anticorpos quiméricos, anticorpos humanizados e anticorpos humanos.

[0068] Em algumas modalidades, os anticorpos são anticorpos humanizados.

[0069] O termo “anticorpo murino” aqui se refere a anticorpos monoclonais contra OX40 humano, que são preparados de acordo com o conhecimento e habilidades na técnica. Durante a preparação, um objeto de teste é injetado com o antígeno OX40 e, em seguida, os esplenócitos

(linfócitos B) que expressam o anticorpo que possui a sequência desejada ou características funcionais são separados e, em seguida, os linfócitos B são fundidos com células de mieloma para obter células de hibridoma correspondentes.

[0070] Em algumas modalidades particulares, o anticorpo murino OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende ainda região (ou regiões) constante da cadeia κ, λ de murino ou variante (ou variantes) do mesmo ou compreende ainda região (ou regiões) constante da cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 murino, ou variante (ou variantes) dos mesmos.

[0071] O termo “anticorpo humano” inclui anticorpos com região (ou regiões) variável e constante de sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana. Os anticorpos humanos da presente divulgação podem incluir resíduos de aminoácidos que não são codificados por sequências de imunoglobulina da linha germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica do sítio in vivo ou por mutação somática in vivo).

Entretanto, o termo “anticorpo humano” não se refere a tal anticorpo em que sequências de CDR derivadas de outra espécie de mamífero (como camundongo) da linha germinativa foram enxertadas na sequência de framework humana (isto é, “anticorpo humanizado”).

[0072] O termo “anticorpo humanizado” refere-se a anticorpos gerados por enxerto de sequências de CDR de espécies não humanas em framework de região variável de anticorpo humano; isto é, anticorpos produzidos a partir de diferentes tipos de sequências de framework de anticorpos da linha germinativa humana.

Os anticorpos humanizados superam a resposta heterogênea induzida por anticorpos quiméricos que carregam uma grande quantidade de componentes proteicos heterogêneos.

Essas sequências de framework podem ser obtidas a partir de bancos de dados públicos de DNA ou referências publicadas que incluem sequências de genes de anticorpos da linha germinativa.

Por exemplo, as sequências de DNA da linha germinativa de genes da região variável da cadeia pesada humana e da cadeia leve podem ser obtidas no banco de dados de sequência da linha germinativa humana

“VBase” (www.mrccpe.com.ac.uk/vbase), e também em Kabat, EA,

et al., 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest,

5ª edição.

Para evitar uma diminuição da atividade junto com a diminuição da imunogenicidade, as sequências de FR na região variável do anticorpo humano seriam submetidas a mutação reversa mínima ou mutação reversa para manter a atividade.

Os anticorpos humanizados da presente divulgação também incluem anticorpos humanizados que são obtidos após maturação de afinidade adicional de CDRs por exibição de fago ou exibição de levedura.

[0073] No caso de enxerto de CDR, a afinidade reduzida do anticorpo OX40 resultante (ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) para o antígeno é devido a mudanças ocorridas nos resíduos de framework que são obrigados pelo contato com o antígeno. Essa interação pode ser o resultado da hipermutação nas células somáticas. Portanto, ainda há uma necessidade de enxertar tais aminoácidos de framework do doador no framework de anticorpos humanizados. Os resíduos de aminoácidos do anticorpo OX40 não humano ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo na ligação ao antígeno podem ser identificados pela detecção da sequência e estrutura da região variável do anticorpo monoclonal não humano. Resíduos em um framework de doador de CDR que são diferentes daqueles na linha germinativa podem ser considerados relacionados.

Onde a linha germinal mais próxima não pode ser determinada, a sequência pode ser alinhada contra a sequência de consenso de um subtipo ou contra a sequência de consenso de uma sequência murina com alta porcentagem de similaridade.

Pensa-se que resíduos de framework raros são o resultado de hipermutação em células somáticas e, portanto, desempenham um papel importante na ligação. Em algumas modalidades da presente divulgação, uma cadeia leve do anticorpo do anticorpo humanizado OX40 compreende ainda uma região constante da cadeia leve de uma cadeia kappa, lambda humana ou variante da mesma. A cadeia pesada do OX40 humanizado compreende ainda uma região constante da cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 humana ou a variante da mesma; em particular, uma região constante da cadeia pesada de IgG1 humana.

[0074] O termo “mutação reversa” refere-se à reversão da mutação (ou mutações) de aminoácido na região de FR de um anticorpo humano para o resíduo (ou resíduos) de aminoácido na posição (ou posições) correspondente da fonte de anticorpo original. Normalmente, para evitar a diminuição da imunogenicidade causada por um anticorpo humanizado que, por sua vez, leva à diminuição da atividade, a região variável do anticorpo humanizado pode ser submetida a mutações reversas mínimas para manter a atividade do anticorpo.

[0075] O termo “anticorpo quimérico” é um anticorpo que é formado pela fusão da região variável de um anticorpo não humano com a região constante de um anticorpo humano, o anticorpo quimérico pode aliviar a resposta imune induzida por anticorpo não humano. Como um exemplo, para estabelecer um anticorpo quimérico, o hibridoma secretor de anticorpo monoclonal murino específico deve ser estabelecido em primeiro lugar, um gene de região variável é então clonado a partir de hibridomas de camundongo, então um gene de região constante de um anticorpo humano é clonado conforme desejado, a região variável de camundongo. O gene é ligado ao gene da região constante humana para formar um gene quimérico que pode ser inserido em um vetor humano e, finalmente, a molécula de anticorpo quimérico é expressa em um sistema industrial eucariótico ou procariótico. A região constante de um anticorpo humano é selecionada a partir da região (ou regiões) constante da cadeia pesada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana ou variante (ou variantes) das mesmas. Em particular, um anticorpo quimérico compreende região (ou regiões) constante da cadeia pesada de IgG1 humana.

[0076] O termo “fragmento de ligação ao antígeno” ou “fragmento funcional” de um anticorpo se refere a um ou mais fragmentos do anticorpo que retêm a capacidade de se ligar especificamente a um antígeno (por exemplo, OX40). Foi demonstrado que fragmentos de um anticorpo de comprimento total podem ser usados para atingir a função de ligação ao antígeno. Exemplos dos fragmentos de ligação contidos no termo “fragmento de ligação ao antígeno” de um anticorpo envolvem: (i) fragmento Fab, um fragmento monovalente que consiste nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) fragmento F (ab’) 2, um fragmento bivalente formado por dois fragmentos Fab conectados por ponte (ou pontes) de dissulfeto na região de dobradiça; (iii) fragmento Fd que consiste nos domínios de VH e CH1; (iv) fragmento Fv que consiste nos domínios de VH e VL de um braço do anticorpo; (v) domínio único ou fragmento dAb (Ward et al., (1989) Nature, 341:544 a 546), que consiste em um domínio de VH;; e (vi) região determinante de complementaridade isolada (CDR); ou (vii) opcionalmente, uma combinação de dois ou mais CDRs isolados conectados por um ligante sintético.

[0077] Além disso, o domínio de VL e o domínio de VH do fragmento Fv são codificados por dois genes separados, entretanto, eles podem ser ligados por um ligante sintético usando métodos recombinantes, para gerar uma única cadeia de proteína na qual uma molécula monovalente é formada pareando o domínio de VL com o VH (denominado como Fv de cadeia simples (scFv); consultar, por exemplo, Bird et al. (1988): Science 242:423 a 426; e Huston et al (1988) Proc. Natl.

Acad. Sci USA 85:5879 a 5883). Esses anticorpos de cadeia única também se destinam a ser incluídos no termo “fragmento de ligação ao antígeno” de um anticorpo. Tais fragmentos de anticorpo são obtidos usando técnicas convencionais conhecidas pelas pessoas versadas na técnica, e podem ser rastreados para fragmentos funcionais usando o mesmo método que aquele para um anticorpo intacto. As porções de ligação ao antígeno podem ser produzidas por tecnologia de DNA recombinante ou por digestão enzimática ou química de uma imunoglobulina intacta. Os anticorpos podem estar nas formas de diferentes isotipos, por exemplo, anticorpo IgG (por exemplo, subtipo IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE ou IgM.

[0078] Em algumas modalidades, “fragmento de ligação ao antígeno” refere-se a Fab, Fv, sFv, F (ab’) 2, anticorpo linear, anticorpo de cadeia única, scFv, sdAb, sdFv, nanocorpo, pepticorpo, anticorpo de domínio e anticorpo multiespecífico (anticorpo biespecífico, diacorpo, triacorpo e tetracorpo, tandem di-scFv, tandem tri-scFv) com atividade de ligação ao antígeno.

[0079] Fab é um fragmento de anticorpo obtido pelo tratamento de uma molécula de anticorpo IgG com uma papaína (que cliva o resíduo de aminoácido na posição 224 na cadeia H). O fragmento obtido tem um peso molecular de cerca de

50.000 e atividade de ligação ao antígeno, em que quase metade da cadeia H até o terminal N e toda a cadeia L estão ligadas por meio de uma ligação dissulfeto. O Fab na presente divulgação pode ser produzido tratando o anticorpo monoclonal da presente divulgação (que reconhece especificamente OX40 humano e se liga à sequência de aminoácidos do domínio extracelular ou estrutura 3D da mesma) com papaína. Além disso, o Fab pode ser produzido inserindo DNA que codifica Fab do anticorpo em um vetor de expressão procariota ou vetor de expressão eucariótica e introduzindo o vetor em um procariota ou eucariota para expressar o Fab.

[0080] “F(ab’)2” refere-se a um fragmento de anticorpo com um peso molecular de cerca de 100.000 e atividade de ligação ao antígeno, que é obtido por digestão da parte a jusante das duas ligações dissulfeto na região de dobradiça de IgG por pepsina. F(ab’)2 contém dois Fabs conectados na região de dobradiça.

[0081] F(ab’)2 da presente divulgação pode ser produzido tratando o anticorpo monoclonal da presente divulgação com pepsina. Além disso, F(ab’)2 pode ser produzido conectando o Fab’ descrito abaixo por meio de ligação tioéter ou ligação dissulfeto.

[0082] Fab’ é um fragmento de anticorpo tendo um peso molecular de cerca de 50.000 e tendo atividade de ligação ao antígeno, que é obtido pela clivagem da ligação dissulfeto na região de dobradiça do F(ab’) 2 mencionado acima. O Fab’ da presente divulgação pode ser produzido tratando F(ab’) 2 da presente divulgação com um agente de redução, tal como ditiotreitol.

[0083] Além disso, o Fab’ pode ser produzido inserindo DNA que codifica Fab’ do anticorpo em um vetor de expressão procariótica ou vetor de expressão eucariótica e introduzindo o vetor em um procariota ou eucariota para expressar o Fab’.

[0084] O termo “anticorpo de cadeia simples”, “Fv de cadeia simples” ou “scFv” refere-se a uma molécula que compreende o domínio variável da cadeia pesada do anticorpo (ou região; VH) conectado ao domínio variável da cadeia leve do anticorpo (ou região; VL) por um ligante. Tais moléculas de scFv têm estrutura geral de NH2-VL-ligante-VH-COOH ou NH2-VH-ligante-VL-COOH. Um ligante adequado na técnica anterior consiste em sequência de aminoácidos GGGGS repetida ou variante da mesma, por exemplo, variante com 1 a 4 repetições (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci.

USA 90:6444 a 6448) Outros ligantes que podem ser usados na presente divulgação são descritos por Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725 a 731, Choi et al. (2001), Eur. J.

Immunol. 31: 94 a 106, Hu et al. (1996), Cancer Res. 56: 3055 a 3061, Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293: 41 a 56 e Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.

[0085] O scFv da presente divulgação pode ser produzido pelas seguintes etapas: obtenção de cDNAs que codificam a VH e VL do anticorpo monoclonal da presente divulgação, construção de um DNA que codifica o scFv, inserção do DNA em um vetor de expressão procariótica ou eucariótica e, em seguida, introduzindo o vetor de expressão em um procarioto ou eucarioto para expressar o scFv.

[0086] “Diacorpo” é um fragmento de anticorpo em que o scFv é dimerizado e é um fragmento de anticorpo com atividade de ligação ao antígeno divalente. Na atividade de ligação ao antígeno divalente, os dois antígenos podem ser iguais ou diferentes.

[0087] O diacorpo da presente divulgação pode ser produzido pelas seguintes etapas: obtenção de cDNAs que codificam VH e VL do anticorpo monoclonal da presente divulgação, construção de um DNA que codifica scFv para fazer com que o comprimento de um peptídeo ligante seja de 8 ou menos resíduos de aminoácidos, inserção do DNA em um vetor de expressão procariótica ou eucariótica e, em seguida, introdução do vetor de expressão em um procariota ou eucariota para expressar o diacorpo.

[0088] “dsFv” é obtido substituindo um resíduo de aminoácido em cada uma de VH e VL por um resíduo de cisteína e, em seguida, conectando os polipeptídeos substituídos por meio de uma ligação dissulfeto entre os dois resíduos de cisteína. Os resíduos de aminoácidos a serem substituídos por um resíduo de cisteína podem ser selecionados com base na previsão da estrutura tridimensional do anticorpo de acordo com os métodos conhecidos (Protein Engineering, 7, 697 (1994)).

[0089] O dsFv da presente divulgação pode ser produzido pelas seguintes etapas: obtenção de cDNAs que codificam a VH e VL do anticorpo monoclonal da presente divulgação, construção de um DNA que codifica o dsFv, inserção do DNA em um vetor de expressão procariótica ou eucariótica e, em seguida, introduzindo o vetor de expressão em um procarioto ou eucarioto para expressar o dsFv.

[0090] O “peptídeo contendo CDR” é constituído pela incorporação de uma ou mais regiões nas CDRs de VH ou VL. Os peptídeos contendo CDRs múltiplas podem ser ligados diretamente ou por meio de um ligante de peptídeo adequado.

[0091] O peptídeo contendo CDR da presente divulgação pode ser produzido pelas seguintes etapas: construção de DNA que codifica as CDRs de VH e VL do anticorpo monoclonal na presente divulgação, inserção do DNA em um vetor de expressão procariótica ou um vetor de expressão eucariótica, o vetor de expressão é então introduzido em procariotas ou eucariotas para expressar o peptídeo. O peptídeo contendo CDR também pode ser produzido por um método de síntese química, como o método Fmoc ou o método tBoc.

[0092] Como usado na presente divulgação, o termo “framework (FR)” refere-se a uma parte do domínio variável, seja VL ou VH, que serve como um arcabouço para as alças de ligação ao antígeno (CDRs) deste domínio variável.

Essencialmente, é um domínio variável sem CDRs.

[0093] O termo “diferença de aminoácidos” refere-se à diferença (ou diferenças) entre um polipeptídeo e a variante (variantes) do mesmo em posição (ou posições) de aminoácido específica no fragmento de polipeptídeo, em que a variante (variantes) pode ser obtida por substituir, inserir ou deletar aminoácido (ou aminoácidos) em posição (ou posições) específica no polipeptídeo.

[0094] O termo “epítopo” refere-se aos sítios em um antígeno que se ligam especificamente a uma imunoglobulina ou anticorpo. O epítopo pode ser formado por aminoácidos adjacentes ou por aminoácidos não adjacentes que foram aproximados devido ao dobramento terciário de uma proteína.

O epítopo formado por aminoácidos adjacentes é tipicamente retido após exposição a solvente desnaturante, enquanto o epítopo formado por dobramento terciário está tipicamente ausente após tratamento com solvente desnaturante. Os epítopos normalmente incluem pelo menos 3 a 15 aminoácidos em uma conformação espacial única. Os métodos para determinar o epítopo são bem conhecidos na técnica, compreendendo imunotransferência e ensaio de imunoprecipitação e semelhantes. Métodos para determinar a conformação espacial de um epítopo incluem técnicas na técnica e técnicas aqui descritas, como cristalografia de raios-X e ressonância magnética nuclear bidimensional e semelhantes.

[0095] O termo “liga-se especificamente a” usado na presente invenção refere-se à ligação de um anticorpo a um epítopo em um antígeno predeterminado. Normalmente, o anticorpo se liga a um antígeno predeterminado com uma constante de dissociação de equilíbrio (KD) de aproximadamente menos de 10-7 M ou até menos, e a afinidade do anticorpo para a ligação ao antígeno predeterminado é pelo menos duas vezes maior do que para ligação a antígenos não específicos (como BSA) diferente do antígeno predeterminado ou antígenos intimamente relacionados, conforme medido em um instrumento por meio da técnica de ressonância plasmônica de superfície (SPR), em que o OX40 humano recombinante é usado como um analito enquanto o anticorpo é usado como um ligante. O termo “um anticorpo que reconhece um antígeno” pode ser usado indistintamente aqui com o termo “um anticorpo que se liga especificamente a...”.

[0096] O termo “KD” refere-se à constante de equilíbrio de dissociação para uma interação anticorpo-antígeno particular. Normalmente, o anticorpo da presente divulgação se liga a OX40 humano com uma constante de equilíbrio de dissociação (KD) inferior a cerca de 10-7 M, por exemplo, inferior a cerca de 10-8 M, 10-9 M ou 10-10 M ou ainda menos; por exemplo, conforme determinado pela Tecnologia de ressonância de plasma de superfície (SPR) no instrumento Biacore.

[0097] Quando o termo “competição” é usado no contexto de proteínas de ligação ao antígeno (por exemplo, proteínas de ligação ao antígeno neutralizantes ou anticorpos neutralizantes) que competem pelo mesmo epítopo, significa que ocorre competição entre as proteínas de ligação ao antígeno, que é determinado por um ensaio no qual: uma proteína de ligação ao antígeno a ser testada (por exemplo, um anticorpo ou um fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) evita ou inibe (por exemplo, reduz) a ligação específica de uma proteína de ligação ao antígeno de referência (por exemplo, um ligante ou anticorpo de referência) para um antígeno comum (por exemplo, um antígeno OX40 ou fragmento do mesmo). Numerosos tipos de ensaios de ligação competitiva estão disponíveis para determinar se uma proteína de ligação ao antígeno compete com outra. Estes ensaios são, por exemplo, radioimunoensaio direto ou indireto em fase sólida (RIA), imunoensaio enzimático direto ou indireto em fase sólida (EIA), ensaio de competição em sanduíche (consultar, por exemplo, Stahli et al, 1983, Methods in Enzymology 9: 242 a 253); EIA de biotina-avidina direta em fase sólida (consultar, por exemplo, Kirkland et al, 1986, J. Immunol.

137: 3614 a 3619), ensaio de marcação direta em fase sólida, ensaio sanduíche de marcação direta em fase sólida (consultar, por exemplo, Harlow e Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); RIA de marcação direta em fase sólida com marcador I-125 (consultar, por exemplo, Morel et al, 1988, Molec. Immunol. 25: 7 a 15); e RIA de marcação direta (Moldenhauer et al, 1990, Scand. J.

Immunol. 32: 77 a 82). Normalmente, o ensaio envolve o uso de um antígeno purificado capaz de se ligar a uma proteína de ligação ao antígeno de teste não marcada e a uma proteína de ligação ao antígeno de referência marcada (o antígeno é carregado em uma superfície sólida ou superfície celular).

A inibição competitiva é determinada medindo a quantidade de marcador ligado à superfície sólida ou à superfície celular na presença da proteína de ligação ao antígeno de teste.

Normalmente, a proteína de ligação ao antígeno de teste está presente em excesso. As proteínas de ligação ao antígeno identificadas por ensaio competitivo (proteína de ligação ao antígeno competitiva) incluem: proteínas de ligação ao antígeno que se ligam ao mesmo epítopo que a proteína de ligação ao antígeno de referência; e proteínas de ligação ao antígeno que se ligam a um epítopo que é suficientemente próximo ao epítopo ao qual a proteína de ligação ao antígeno de referência se liga, onde os dois epítopos interferem espacialmente um com o outro para impedir a ligação. Detalhes adicionais sobre métodos para determinar a ligação competitiva são fornecidos nos exemplos neste documento.

Normalmente, quando uma proteína de ligação ao antígeno competitiva está presente em excesso, ela irá inibir (por exemplo, reduzir) pelo menos 40 a 45%, 45 a 50%, 50 a 55%, 55 a 60%, 60 a 65%, 65 a 70%, 70 a 75% ou ainda mais da ligação específica da proteína de ligação ao antígeno de referência ao antígeno comum. Em certos casos, a ligação é inibida em pelo menos 80 a 85%, 85 a 90%, 90 a 95%, 95 a 97% ou até mais.

[0098] O termo “reação cruzada” refere-se à capacidade do anticorpo da presente invenção para se ligar a OX40 de diferentes espécies. Por exemplo, um anticorpo da presente invenção que se liga ao OX40 humano também pode se ligar ao OX40 de outra espécie. A reatividade cruzada é medida pela detecção da reatividade específica com o antígeno purificado em ensaios de ligação (por exemplo, SPR e ELISA), ou pela detecção da ligação ou interação funcional com células que expressam fisiologicamente OX40. Os métodos para determinar a reatividade cruzada incluem ensaios de ligação padrão como aqui descritos, como a análise de ressonância de plasmon de superfície (SPR) ou citometria de fluxo.

[0099] O termo “inibição” ou “bloqueio” é usado indistintamente e abrange a inibição/bloqueio parcial e total.

[00100] O termo “inibição de crescimento” (por exemplo, quando aplicado a células) destina-se a referir-se a qualquer diminuição mensurável no crescimento celular.

[00101] Os termos “induzindo uma resposta imune” e “aumentando uma resposta imune” são usados indistintamente e referem-se a uma resposta imune contra a estimulação de um antígeno específico (isto é, passivo ou adaptativo). O termo “indução” no contexto de indução de CDC ou ADCC refere-se à estimulação de um mecanismo específico de morte celular direta.

[00102] “Citotoxicidade mediada por células dependente de anticorpos” ou “ADCC” refere-se a tal forma de citotoxicidade, em que as imunoglobulinas secretoras que se ligam a receptores Fc (FcR) presentes em certas células citotóxicas (como células NK, neutrófilos e macrófagos) fazem com que essas células efetoras citotóxicas se liguem especificamente a células-alvo portadoras de antígeno e, em seguida, matem as células-alvo por meio de citotoxinas. As células principais (células NK) que medeiam ADCC expressam FcyRIII sozinho, enquanto os monócitos expressam FcyRI, FcyRII e FcyRIII. A expressão de FcR em células hematopoiéticas está resumida na Tabela 3 na página 464 em Ravetch e Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457 a 492 (1991). De modo a avaliar a atividade ADCC da molécula de interesse, um ensaio ADCC in vivo pode ser realizado, tal como o descrito na Patente US Nº 5.500.362 ou 5.821.337 ou Patente US Nº

6.737.056 (Presta). As células efetoras úteis para tais ensaios incluem células PBMC e NK. Alternativamente, a atividade ADCC da molécula de interesse pode ser avaliada in vivo, por exemplo, em um modelo animal como o divulgado em Clynes et al. PNAS (USA) 95:652 a 656 (1998). Além disso, o segmento Fc de IgG pode ser modificado para reduzir ou eliminar o efeito ADCC dos anticorpos. A modificação refere- se a mutações na região constante da cadeia pesada do anticorpo, tais como mutações selecionadas do grupo que consiste em N297A, L234A, L235A de IgG1; Quimera IgG2/4, F235E de IgG4 e mutação L234A/E235A.

[00103] O termo “citotoxicidade dependente do complemento” ou “CDC” refere-se à lise de células alvo na presença de complemento. A via clássica de ativação do complemento é iniciada pela ligação do primeiro componente do sistema do complemento (C1q) a um anticorpo (da subclasse apropriada), que se ligou ao antígeno cognato do mesmo. Para avaliar a ativação do complemento, um ensaio de CDC pode ser realizado, por exemplo, conforme descrito em Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996). Variantes de polipeptídeo tendo sequência (ou sequências) de aminoácidos da região Fc modificada (polipeptídeos com região (ou regiões) Fc variante), bem como tendo capacidade de ligação a C1q aumentada ou diminuída, são descritas, por exemplo, na Patente US Nº 6.194.551B1 e WO 1999/51642. Consultar também, por exemplo, Idusogie et al., J. Immunol. 164:4178 a 4184 (2000).

[00104] Como usado na presente divulgação, o termo “molécula de ácido nucleico” refere-se a molécula de DNA e molécula de RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser um filamento simples ou filamento duplo, mas em particular DNA de filamento duplo. Um ácido nucleico é considerado “operacionalmente ligado”, quando é colocado em uma relação funcional com outra sequência de ácido nucleico. Por exemplo,

um promotor ou intensificador está operacionalmente ligado a uma sequência de codificação, quando tem efeito na transcrição da sequência.

[00105] O termo “vetor” refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de entregar outro ácido nucleico ao qual foi ligada. Em uma modalidade, o vetor é um “plasmídeo”, que se refere a uma alça de DNA de filamento duplo cíclico na qual segmento (ou segmentos) de DNA adicionais podem ser ligados. Em outra modalidade, o vetor é um vetor viral, em que segmentos de DNA adicionais podem ser ligados ao genoma viral. Os vetores divulgados neste documento são capazes de se autorreplicar na célula hospedeira na qual são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem de replicação bacteriana e vetores epissomais de mamíferos), ou podem ser integrados no genoma de uma célula hospedeira após introdução no célula hospedeira e, portanto, são replicados junto com o genoma do hospedeiro (por exemplo, vetores de mamíferos não epissomais).

[00106] Os métodos para a produção e purificação de anticorpos e fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos são bem conhecidos na técnica, por exemplo, A Laboratory Manual for Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova York, capítulos 5 a 8 e 15. Por exemplo, os camundongos podem ser imunizados com OX40 humano ou fragmentos do mesmo, e os anticorpos resultantes podem então ser renaturados, purificados e sequenciados para sequências de aminoácidos usando métodos convencionais bem conhecidos na técnica. Os fragmentos de ligação ao antígeno também podem ser preparados por métodos convencionais. Os anticorpos ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos da presente divulgação são projetados para inserir uma ou mais regiões de FR humano em regiões de CDR não humano. As sequências da linha germinativa de FR humano podem ser obtidas no site da ImMunoGeneTics (IMGT) http://imgt.cines.fr ou no The Immunoglobulin Facts Book, 2001 ISBN012441351, alinhando-se com o banco de dados do gene da linha germinativa variável do anticorpo humano IMGT usando o software MOE.

[00107] Os anticorpos ou os fragmentos de ligação ao antígeno na presente divulgação podem ser preparados e purificados usando métodos convencionais. Por exemplo, as sequências de cDNA que codificam uma cadeia pesada e uma cadeia leve podem ser clonadas e recombinadas no vetor de expressão GS. O vetor de expressão de imunoglobulina recombinante pode então ser transfectado de forma estável em células CHO. Como um método mais recomendado na técnica, o sistema de expressão de mamífero pode resultar na glicosilação de anticorpos, tipicamente no terminal N altamente conservado na região de FC. Os clones estáveis podem ser obtidos através da expressão de um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno humano. Os clones positivos podem ser expandidos em um meio de cultura sem soro para a produção de anticorpos em biorreatores. O meio de cultura, para o qual um anticorpo foi segregado, pode ser purificado e recolhido por técnicas convencionais. O anticorpo pode ser submetido a filtração e concentração usando técnicas comuns. Misturas solúveis e multímeros podem ser efetivamente removidos por técnicas comuns, como peneira molecular ou troca iônica. O produto obtido deve ser imediatamente congelado, por exemplo a -70 °C, ou pode ser liofilizado.

[00108] O anticorpo monoclonal (mAb) refere-se a um anticorpo obtido a partir de um único clone de cepa celular que é, mas não se limita a clone eucariótico, procariótico ou fago de cepa celular. Os anticorpos monoclonais e fragmento de ligação ao antígeno dos mesmos podem ser obtidos, por exemplo, por tecnologias de hibridoma, tecnologias recombinantes, tecnologias de exibição de fago, tecnologias sintéticas (por exemplo, enxerto de CDR) ou outras tecnologias conhecidas na técnica.

[00109] O termo “célula hospedeira” refere-se a uma célula na qual um vetor de expressão foi introduzido. As células hospedeiras podem incluir microrganismos (como bactérias), plantas ou células animais. As bactérias susceptíveis de serem transformadas incluem membros de

Enterobacteriaceae, tais como Escherichia coli ou Salmonella; Bacillaceae, como Bacillus subtilis; Pneumococo; Streptococcus e Haemophilus influenzae. Os microrganismos adequados incluem Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris. As linhas de células hospedeiras de animais adequadas incluem células CHO (Chinese Hamster Ovary Cell Line), NS0 e células 293.

[00110] “Modificação conservadora” ou “substituição ou substituição conservadora” significa a substituição de outros aminoácidos que mostram características semelhantes (tais como carga, tamanho da cadeia lateral, hidrofobicidade/hidrofilicidade, conformação da cadeia principal e rigidez, etc.) para os aminoácidos em uma proteína, de modo que a modificação pode ser realizada frequentemente sem alterar a atividade biológica da proteína. As pessoas versadas na técnica sabem que, geralmente, a substituição de um único aminoácido em uma região não essencial de um polipeptídeo não altera substancialmente a atividade biológica (consultar por exemplo, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., página 224 (4ª edição)).

Além disso, é improvável que a substituição de aminoácidos com estrutura ou função semelhante resulte na perda de atividade biológica.

[00111] “Quantidade eficaz” envolve uma quantidade suficiente para melhorar ou prevenir um sintoma ou sinal de um sintoma ou condição médica. Quantidade efetiva também significa uma quantidade suficiente para permitir ou facilitar o diagnóstico. Uma quantidade eficaz para um determinado paciente ou indivíduo veterinário pode variar dependendo de fatores como a condição a ser tratada, a saúde geral do paciente, a via e dosagem de administração e a gravidade dos efeitos colaterais. Uma quantidade eficaz pode ser a dosagem máxima ou protocolo de dosagem que evita efeitos colaterais significativos ou efeitos tóxicos.

[00112] “Exógeno” refere-se a substâncias que são produzidas fora de um organismo, célula ou corpo humano, dependendo do contexto.

[00113] “Endógeno” refere-se a substâncias que são produzidas dentro de um organismo, célula ou corpo humano, dependendo do contexto.

[00114] A “sequência mutada” mencionada na presente divulgação refere-se a uma sequência de nucleotídeos e sequência de aminoácidos com várias percentagens de identidade de sequência com aquelas da presente divulgação, após modificar a sequência de nucleotídeos e a sequência de aminoácidos da presente divulgação por substituição apropriada, inserção ou exclusão. A identidade de sequência pode ser de pelo menos 85%, 90% ou 95%, não exemplos limitantes incluem 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%,

93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% e 100%. A comparação de sequências entre duas sequências e a determinação da porcentagem de identidade podem ser realizadas usando o algoritmo BLASTN/BLASTP disponível no site do National Center For Biotechnology Institute, com configurações padrão.

[00115] Como usado na presente divulgação, “homologia” ou “identidade” refere-se a uma semelhança de sequência entre duas sequências polinucleotídicas ou entre duas sequências polipeptídicas. Quando uma posição em ambas as sequências a serem comparadas é ocupada pela mesma base ou subunidade monomérica de aminoácido, por exemplo, quando uma posição em cada uma das duas moléculas de DNA é ocupada por adenina, então as moléculas são homólogas nessa posição.

A porcentagem de homologia entre duas sequências é uma função do número de posições correspondentes ou homólogas compartilhadas pelas duas sequências dividido pelo número de todas as posições a serem comparadas e, em seguida, multiplicado por 100. Por exemplo, quando duas sequências estão alinhadas de forma otimizada, se 6 de 10 posições nas duas sequências são emparelhadas ou homólogas, então as duas sequências são conhecidas como 60% homólogas; se 95 de 100 posições nas duas sequências são emparelhadas ou homólogas, então as duas sequências são conhecidas como 95% homólogas.

Geralmente, duas sequências são comparadas quando o alinhamento fornece a porcentagem máxima de homologia.

[00116] Como usado na presente divulgação, as expressões “célula”, “linha celular” e “cultura de células” são usadas indistintamente e todas essas designações envolvem sua progênie. Assim, “transformante” e “célula transformada” incluem as células em questão primárias e a cultura derivada das mesmas, independentemente do número de passagens. Também deve ser entendido que toda a progênie pode não ser precisamente idêntica no aspecto do conteúdo de DNA, devido a mutações intencionais ou não. A progênie mutante exibindo a mesma função ou atividade biológica como rastreada para as células originalmente transformadas está incluída. Onde designações distintas são mencionadas, isso será claramente entendido de acordo com o contexto.

[00117] Como usado na presente divulgação, “reação em cadeia da polimerase” ou “PCR” refere-se a um procedimento ou técnica em que pequenas quantidades de uma porção específica de ácido nucleico, RNA e/ou DNA, são amplificadas conforme descrito em, por exemplo, Pat. Nº US 4.683.195.

Geralmente, a informação da sequência no término ou além da região de interesse precisa estar disponível, de modo que os oligonucleotídeos iniciadores possam ser projetados; estes iniciadores serão idênticos ou semelhantes em sequência à cadeia complementar do molde a ser amplificado. Os nucleotídeos do terminal 5’ dos dois iniciadores podem ser idênticos às extremidades do material a ser amplificado. A PCR pode ser usada para amplificar sequências de RNA específicas, sequências de DNA específicas do genoma total e cDNA transcrito de RNA celular total, sequências de bacteriófagos ou plasmídeos, etc. Consultar geralmente Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol.

51: 263; Editor Erlich, (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, NY). A PCR usada na presente divulgação é considerada um exemplo (mas não o único) de métodos de reação de polimerase para amplificar uma amostra de ácido nucleico para ser testada. O método compreende o uso de sequências de ácido nucleico conhecidas como iniciadores em combinação com a polimerase de ácido nucleico para amplificar ou gerar uma porção específica de ácido nucleico.

[00118] “Opcional” ou “opcionalmente” significa que o evento ou circunstância que se segue pode (mas não necessariamente) ocorrer, e a descrição inclui os casos em que o evento ou circunstância ocorre ou não ocorre. Por exemplo, “opcionalmente contém 1 a 3 regiões variáveis da cadeia pesada do anticorpo” significa que as regiões variáveis da cadeia pesada do anticorpo com sequência específica podem estar, mas não precisam estar, presentes.

[00119] “Composição farmacêutica” refere-se a uma mistura contendo um ou mais anticorpos ou os fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, de acordo com a presente divulgação, e outros componentes químicos, tais como portadores ou excipientes fisiologicamente/farmaceuticamente aceitáveis. A composição farmacêutica visa promover a administração a um organismo, facilitando a absorção do componente ativo e, assim, exibindo um efeito biológico.

[00120] O termo “câncer” se refere a ou descreve uma condição fisiológica em mamíferos, caracterizada pelo crescimento celular desregulado. Exemplos de câncer incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia ou malignidades linfoides. Exemplos mais específicos de tais cânceres incluem, mas não estão limitados a, carcinoma de células escamosas (por exemplo, carcinoma epitelial de células escamosas), câncer de pulmão (incluindo câncer de pulmão de células pequenas, câncer de pulmão de células não pequenas, adenocarcinoma, e carcinoma de células escamosas do pulmão), câncer peritoneal, carcinoma hepatocelular, carcinoma gástrico (incluindo câncer gastrointestinal e câncer estromal gastrointestinal), câncer pancreático, glioblastoma, câncer cervical, câncer ovariano, câncer de fígado, câncer de bexiga, câncer de uretra, tumor de fígado, câncer de mama, câncer de cólon, câncer de reto, câncer colorretal, câncer do endométrio ou câncer uterino, câncer de glândulas salivares, câncer de rim, câncer de próstata, câncer vulvar, câncer da tireoide, câncer anal,

câncer de pênis, melanoma, melanoma de disseminação superficial, melanoma sardento maligno, melanoma acral, melanoma nodular, mieloma múltiplo e linfoma de células B, leucemia linfocítica crônica (CLL), leucemia linfoblástica aguda (LLA), leucemia de células pilosas, leucemia mieloblástica crônica e distúrbio linfoproliferativo pós- transplante (PTLD), bem como proliferação anormal de vasos sanguíneos associada a facomatoses, edema (como aqueles associados a tumores cerebrais) e síndrome de Meigs, tumor cerebral e câncer cerebral, e câncer de cabeça e pescoço e metástases relacionadas dos mesmos.

[00121] Em certas modalidades, os cânceres adequados para serem tratados pelo anticorpo OX40 ou o fragmento do mesmo na presente divulgação incluem câncer de mama, câncer colorretal, câncer retal, câncer de pulmão de células não pequenas, glioblastoma, tumor linfático não Hodgkin (NHL ), carcinoma de células renais, câncer de próstata, câncer de fígado, câncer de pâncreas, sarcoma de tecidos moles, sarcoma de Kaposi, carcinoma carcinoide, câncer de cabeça e pescoço, câncer de ovário, mesotelioma e mieloma múltiplo. Em algumas modalidades, o câncer é selecionado do grupo que consiste em: câncer de pulmão de células não pequenas, glioblastoma, neuroblastoma, melanoma, câncer de mama (por exemplo, câncer de mama triplo negativo), carcinoma gástrico, câncer colorretal (CRC) e carcinoma hepatocelular. Além disso, em algumas modalidades, o câncer é selecionado do grupo que consiste em: câncer de pulmão de células não pequenas, câncer colorretal, glioblastoma e câncer de mama (por exemplo, câncer de mama triplo negativo), incluindo metástases desses cânceres.

[00122] Os termos “distúrbio proliferativo celular” e “distúrbio proliferativo” referem-se a distúrbios associados a um certo grau de proliferação celular anormal. Em uma modalidade, o distúrbio proliferativo celular se refere ao câncer.

[00123] O termo “tumor” refere-se a todo o crescimento e proliferação de células neoplásicas, independentemente de maligno ou benigno, e todas as células e tecidos pré- cancerosos e cancerosos.

[00124] Os termos “câncer”, “canceroso”, “distúrbio proliferativo celular”, “distúrbio proliferativo” e “tumor” não são mutuamente exclusivos quando referidos na presente divulgação.

[00125] “Administração”, “administrando” e “tratamento”, quando aplicado a um animal, se humano, indivíduo, célula, tecido, órgão ou fluido biológico, refere-se ao contato de um agente farmacêutico, terapêutico, de diagnóstico exógeno ou composição com o animal, humano, indivíduo, célula, tecido, órgão ou fluido biológico.

“Administração”, “administrando” e “tratamento” podem referir-se a métodos terapêuticos, farmacocinéticos, diagnósticos, de pesquisa e experimentais. O tratamento de uma célula envolve o contato de um reagente com uma célula, bem como o contato de um reagente com um fluido em que o referido fluido está em contato com a célula.

“Administração”, “administrando” e “tratamento” também significam tratamento in vivo e ex vivo de, por exemplo, uma célula, usando um reagente, diagnóstico, composição de ligação ou usando outra célula. “Tratamento” quando aplicado a um ser humano, veterinário ou indivíduo de pesquisa, refere-se a tratamento terapêutico, medidas profiláticas ou preventivas, pesquisas, bem como aplicações de diagnóstico.

[00126] “Para tratar” significa a administração interna ou externa de um agente terapêutico (tal como uma composição compreendendo qualquer um dos anticorpos ou fragmento de ligação ao antígeno da presente divulgação; ou uma molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo) a um paciente com uma ou mais doenças ou sintomas para os quais o agente terapêutico era conhecido por apresentar atividade terapêutica. Normalmente, o agente terapêutico é administrado em uma quantidade eficaz para aliviar uma ou mais doenças ou sintomas no paciente ou população tratada, seja induzindo a regressão de tal sintoma (ou sintomas) ou inibindo a progressão de tal sintoma (ou sintomas) para qualquer grau clinicamente mensurável. A quantidade de um agente terapêutico que é eficaz para aliviar qualquer doença ou sintoma específico (também denominado como “quantidade terapeuticamente eficaz”) pode variar de acordo com fatores como o estado de doença, idade e peso do paciente e a capacidade do medicamento para provocar um efeito desejado no paciente. Se um sintoma de doença foi aliviado pode ser avaliado por qualquer medição clínica normalmente usada por médicos ou outros profissionais de saúde qualificados para avaliar a gravidade ou o estado de progressão desse sintoma.

Embora a modalidade da presente divulgação (por exemplo, um método de tratamento ou artigo de fabricação) possa não ser eficaz no alívio de cada sintoma de doença de interesse, ela deve aliviar o sintoma (ou sintomas) de doença alvo de interesse em um número estatisticamente significativo de indivíduos como determinado por qualquer teste estatístico conhecido na técnica, como teste t de Student, teste do qui- quadrado, teste em U de acordo com Mann e Whitney, teste de Kruskal-Wallis (teste H), teste de Jonckheere-Terpstra e teste de Wilcoxon.

[00127] O termo “prevenção do câncer” refere-se a retardar, inibir ou prevenir o aparecimento do câncer em mamíferos; a iniciação do desenvolvimento de câncer ou tumor não foi confirmada nos mamíferos, mas os mamíferos foram identificados como sendo suscetíveis ao câncer, por exemplo,

por triagem genética ou outros métodos. O termo também inclui o tratamento de um mamífero que sofre de uma condição pré- cancerosa, de modo a evitar que a condição pré-cancerosa progrida para um tumor maligno ou mesmo para atingir a regressão.

Descrição Detalhada da Invenção

[00128] Em seguida, a presente divulgação é ainda descrita com referência aos exemplos. Entretanto, o escopo da presente divulgação não está limitado às mesmas. Nos exemplos, onde as condições específicas não são descritas, os experimentos são geralmente realizados sob condições convencionais, conforme descrito em Antibodies, A Laboratory Manual and Molecular Cloning Manual, por Cold Spring Harbor, ou sob condições propostas pelos fabricantes do material ou produto. Quando a fonte dos reagentes não é fornecida especificamente, os reagentes estão disponíveis comercialmente.

Exemplo 1: Preparação de anticorpos

[00129] A biblioteca de anticorpos monoclonais anti- OX40 humano foi gerada imunizando camundongos. Camundongos experimentais das cepas BalB/C e A/J (Centro de Medicina Comparativa, Universidade de Yangzhou, Número de Licença de Produção Animal; SCXK (Jiangsu) 2017-007), fêmea, 10 semanas de idade.

[00130] O antígeno imune era a proteína recombinante de OX40 humana com marcador Fc (OX40-Fc: OX40 Leu29-Ala216 (Acesso#NP_003318), fundido com Fc), e foi adquirido na Acro Biosystems sob o número de catálogo#OX40-H5255, expresso em HEK293 e depois purificado de acordo com o método convencional.

[00131] OX40-Fc foi emulsionado com o adjuvante de Freund: o adjuvante completo de Freund (sigma-aldrich, F5881-10 ML) foi usado para a primeira imunização e o adjuvante incompleto de Freund (sigma-aldrich, F5506-10 ML) foi usado para a redefinição de imunizações de reforço. A proporção de antígeno para adjuvante foi de 1:1, e 25 μg de proteína/200 μl/camundongo foram injetados para cada imunização. Em detalhe, Dia 1 A primeira imunização com adjuvante completo de Freund Dia 21 A segunda imunização com adjuvante de Freund incompleto Dia 35 A terceira imunização com adjuvante de Freund incompleto Dia 42 Amostragem de sangue e teste de concentração sérica Dia 49 A quarta imunização com adjuvante de Freund incompleto Dia 56 Amostra de sangue e teste de concentração sérica.

[00132] A concentração de anticorpo no soro de camundongo e a atividade neutralizante de bloqueio da ligação de OX40/OX40L foram determinados com soro de camundongo pelo método ELISA como descrito no Exemplo 2. Os camundongos com forte concentração sérica, afinidade e capacidade para bloquear a ligação do ligante foram selecionados para uma imunização final e então sacrificados. As células do baço foram fundidas com células de mieloma SP2/0 (ATCC® CRL-1581TM) e inoculadas em uma placa para obter hibridomas. Os hibridomas alvo foram selecionados por ELISA indireto, ELISA de captura e triagem funcional baseada em células como mostrado no Exemplo 2, e as cepas de anticorpos monoclonais foram estabelecidas pelo método de diluição limitada.

[00133] As 19 cepas estabelecidas de anticorpos monoclonais de camundongo OX40 foram produzidas por expressão sem soro, e os anticorpos monoclonais de camundongo purificados foram obtidos por cromatografia de afinidade de proteína A. Células de hibridoma secretoras de anticorpo anti-OX40 ativado foram selecionadas por ELISA indireto, ELISA de captura e triagem de atividade funcional celular.

O breve procedimento de triagem funcional foi o seguinte: A linha celular estável GS-H2/OX40 foi cultivada (adquirida em Genscript, cat#M00608). O anticorpo diluído a ser testado e a solução OX40L (Sino Biological, 13127-H04H) foram preparados e adicionados às células GS-H2/OX40 na fase de crescimento logarítmico. Após o cultivo ter terminado, o sobrenadante celular foi coletado e o conteúdo de IL-8 no sobrenadante foi medido (usando o kit IL-8 humano, Cisbio, cat#62IL8PEB). O anticorpo GPX4 (preparado com referência a 1A7.gr.1 no pedido de patente nº WO2015153513) foi usado como um controle positivo no teste, e hIgG (preparado no laboratório) foi usado como um controle negativo.

[00134] De acordo com a atividade funcional celular, 10 cepas com alta atividade foram selecionadas para clonagem e sequenciamento de genes. Os RNAs totais foram extraídos das células por tecnologia convencional de extração de RNA e, em seguida, os produtos de PCR das regiões variáveis dos anticorpos monoclonais foram obtidos pela reação em cadeia da polimerase de transcrição reversa (RT-PCR). Os produtos de PCR foram resolvidos e recuperados por gel de agarose, depois clonados em um vetor de gene que foi então transformado em E. coli. Várias colônias transformadas foram selecionadas aleatoriamente, e as regiões variáveis de anticorpos monoclonais foram amplificadas por PCR para sequenciamento de genes. As sequências correspondentes dos anticorpos monoclonais murinos exemplares obtidos são mostradas abaixo.

[00135] As sequências da região variável pesada e leve do anticorpo monoclonal murino m4B5 são as seguintes: região variável de cadeia pesada m4B5:

QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTSYGLHWFRQSPGKGLEWLGVIWSG

GSTDYNAAFISRLSISKDDSKSQVFFKMNSLQADDTAIYYCAREEYDVWGTGTTVTVSS SEQ ID NO: 1; região variável de cadeia leve m4B5:

DIQMTQTASSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRL

HSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDVATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK SEQ ID NO: 2.

[00136] A sequências das regiões de CDR de anticorpo monoclonal murino m4B5 são mostrados na Tabela 1: Tabela 1. Sequências da região de CDR de anticorpo monoclonal murino m4B5 Nome Sequência SEQ ID NO HCDR1 SYGLH SEQ ID NO: 3 HCDR2 VIWSGGSTDYNAAFIS SEQ ID NO: 4 HCDR3 EEYDV SEQ ID NO: 5 LCDR1 RASQDISNYLN SEQ ID NO: 6 LCDR2 YTSRLHS SEQ ID NO: 7 LCDR3 QQGNTLPWT SEQ ID NO: 8

[00137] As sequências da região variável de cadeia leve e pesada do anticorpo monoclonal murino m2G3 são como a seguir: região variável de cadeia pesada m2G3:

QVQLKESGPGLVASSQSLSITCTVSGFSLSRYSVHWVRQPPGKGLEWLGMIWDG

GNTDYNSALKSRLSISKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAMYYCARNPLYFSYAMDYWGQGT SVTVSS SEQ ID NO: 9; região variável de cadeia leve m2G3:

DIQMTQSTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTVKLLIIYTSRL

QSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQVNTFPFTFGSGTKLEIK SEQ ID NO: 10.

[00138] As sequências das regiões de CDR de anticorpo monoclonal murino m2G3 são mostrados na Tabela 2: Tabela 2. Sequências da região de CDR de anticorpo monoclonal murino m2G3 Nome Sequência SEQ ID NO HCDR1 RYSVH SEQ ID NO: 11 HCDR2 MIWDGGNTDYNSALKS SEQ ID NO: 12 HCDR3 NPLYFSYAMDY SEQ ID NO: 13 LCDR1 RASQDISNYLN SEQ ID NO: 14 LCDR2 YTSRLQS SEQ ID NO: 15 LCDR3 QQVNTFPFT SEQ ID NO: 16 Exemplo 2: Identificação e triagem de anticorpos por

ELISA

[00139] Método ELISA indireto: O tampão de revestimento 20x foi diluído para 1x usando água desionizada. 100 μl de antígeno OX40-His humano (Acro biosytems, OXL-H52Q8) preparado usando 1x tampão de revestimento (tampão carbonato) para uma concentração final de 2 μg/ml foi adicionado a cada poço e incubado a 4 °C durante a noite ou 37 °C por 2 h. A placa foi lavada uma vez com PBST, 100 μl do anticorpo primário diluído foram adicionados a cada poço (o anticorpo a ser testado foi diluído 5 vezes a partir da concentração de 10.000 ng/ml, resultando em sete gradientes, isto é, 10.000 ng/ml, 2.000 ng/ml, 400 ng/ml, 80 ng/ml, 16 ng/ml, 3,2 ng/ml e 0,64 ng/ml, os poços em branco continham apenas solução de diluição, isto é, 2,5% de leite desnatado em PBST) e incubados a 37 °C por 40 minutos. A placa foi lavada 4 vezes com PBST e o anticorpo secundário marcado com enzima (IgG anticamundongo de cabra marcado com HRP, adquirido na Jackson Immunoresearch, Cat#115036071 ou IgG anti-humano de cabra marcado com HRP, adquirido com Jackson Immunoresearch, Cat#109036098) foi diluído com tampão PBST; 100 μl foram adicionados a cada poço e incubados a 37 °C por 40 min. A placa foi lavada 4 vezes com PBST, e 100 μl de solução de desenvolvimento de TMB foram adicionados a cada poço, incubados por 3 a 15 minutos no escuro em temperatura ambiente, e 50 μl de solução de parada (ácido sulfúrico 1 M) foram adicionados a cada poço. Os parâmetros foram definidos para o leitor de microplaca, o valor OD foi lido a 450 a 630 nm e os dados de teste foram salvos.

[00140] ELISA de captura: O tampão PBS 20x foi diluído para 1x com água desionizada. 100 μl de anticorpo secundário GAM (Jackson Immunoresearch, 115-006-071) preparado com 1x PBS a uma concentração final de 2 μg/ml foi adicionado a cada poço e incubado a 4 °C durante a noite ou 37 °C por 2 h; a placa foi lavada uma vez com PBST, 200 μl de solução de bloqueio (PBST contendo 5% de leite desnatado) foi adicionado a cada poço, incubado a 37 °C por 2 h, e a placa foi lavada com PBST por 4 vezes. 100 μl do anticorpo primário diluído foram adicionados a cada poço (o anticorpo a ser testado foi diluído 5 vezes a partir da concentração de 10.000 ng/ml, resultando em sete gradientes, isto é, 10.000 ng/ml, 2.000 ng/ml, 400 ng/ml, 80 ng/ml, 16 ng/ml, 3,2 ng/ml e 0,64 ng/ml, os poços em branco continham apenas solução de diluição, isto é, 2,5% de leite desnatado em PBST) e incubados a 37 °C por 40 minutos. A placa foi lavada 4 vezes com PBST, OX40- FC-biotina humana (Acro biosystem, OX0-H5255, biotina marcada) foi diluída com 2,5% de leite desnatado em PBST, 100 μl foram adicionados a cada poço, incubado a 37 °C durante 40 min, e a placa foi lavada 4 vezes com PBST. 100 μl de solução de desenvolvimento de TMB foram adicionados a cada poço, incubados por 3 a 15 minutos no escuro em temperatura ambiente, 50 μl de solução de parada (ácido sulfúrico 1 M) foram adicionados a cada poço. Os parâmetros foram definidos para o leitor de microplaca, o valor OD foi lido a 450 a 630 nm e os dados de teste foram salvos.

[00141] Bloqueio de ELISA de ligação de ligante: O tampão de revestimento 20x foi diluído para 1x usando água desionizada, 100 μl de antígeno OX40L-His (Acro biosytems, OXL-H52Q8) preparado usando 1x tampão de revestimento (tampão carbonato) para uma concentração final de 2 μg/ml foi adicionado a cada poço e incubado a 4 °C durante a noite ou 37 °C durante 2 h. A placa foi lavada uma vez com PBST, 200 μl de solução de bloqueio (PBST contendo 5% de leite desnatado) foi adicionado a cada poço, incubado a 37 °C por 2 h, e a placa foi lavada 4 vezes com PBST; o soro/anticorpo de camundongo foi diluído em gradiente com solução de OX40-Fc humana pré-preparada 200 ng/ml (preparada em leite desnatado a 2,5%) e, em seguida, pré-incubado em temperatura ambiente por 40 minutos, depois adicionado à placa OX40L bloqueada em 100 μl/poço e incubado por 40min; a placa foi lavada 4 vezes com PBST; O anticorpo secundário de cabra anti-humano marcado com HRP (GAH-HRP, Jackson Immunoresearch, 109-035-006) foi diluído com tampão PBST; 100 μl foram adicionados a cada poço e incubados a 37 °C por 40 min. A placa foi lavada 4 vezes com PBST, e 100 μl de solução de desenvolvimento de TMB foram adicionados a cada poço, incubados por 3 a 15 minutos no escuro em temperatura ambiente, e 50 μl de solução de parada (ácido sulfúrico 1 M) foram adicionados a cada poço. Os parâmetros foram definidos para o leitor de microplaca, o valor OD foi lido a 450 a 630 nm e os dados de teste foram salvos.

Exemplo 3: Construção e expressão de anticorpo quimérico recombinante anti-OX40

[00142] A região variável da cadeia pesada do anticorpo murino m2G3 e m4B5 (VH) em combinação com a região constante da cadeia pesada da imunoglobulina humana e a região variável da cadeia leve (VL) em combinação com a região constante da cadeia leve Kappa da imunoglobulina humana foram clonados separadamente no vetor de expressão eucariótica, que foi então transfectado em células para produzir anticorpos quiméricos rato-humano.

[00143] O vetor da cadeia pesada foi projetado como segue: peptídeo sinal + sequência da região variável da cadeia pesada + sequência da região constante da IgG1 humana.

[00144] O vetor de cadeia leve foi projetado como segue: peptídeo sinal + sequência da região variável da cadeia leve + sequência da região constante Kappa humana.

[00145] As sequências acima foram inseridas no vetor pCEP4 (Thermofisher, V04450). Após a obtenção do plasmídeo de vetor, o plasmídeo foi extraído e entregue para sequenciamento para verificação. O plasmídeo qualificado foi transfectado em células 293F humanas com PEI e cultivadas continuamente, e as células 293F foram cultivadas em meio sem soro (Shanghai OPM biosciences, OPM-293 CD03) para atingir a fase de crescimento logarítmico para transfecção celular. 21,4 μg de plasmídeo de cadeia leve de anticorpo quimérico e 23,6 μg de plasmídeo de cadeia pesada de anticorpo quimérico foram dissolvidos em 10 ml de Meio de Soro Reduzido Opti-MEM®I (GIBCO, 31985-070) e bem misturados, então 200 μg de PEI foram adicionados, bem misturados e incubado em temperatura ambiente por 15 min e adicionado em células de 50 ml. Condições de cultura de células: 5% de CO2, 37 °C, 125 rpm/min. Durante o período de cultura, meio suplementar foi adicionado no dia 1 e no dia 3 até a viabilidade celular ser inferior a 70%, e o sobrenadante celular foi coletado e centrifugado. Após centrifugação e filtração, a solução de cultura celular foi carregada na coluna de afinidade para purificação do anticorpo, a coluna foi lavada com tampão fosfato, eluída com tampão glicina-ácido clorídrico (pH 2,7, 0,1 M Gly-HCl), neutralizada com ácido clorídrico Tris 1 M pH 9,0, e dialisado contra tampão fosfato, e anticorpos quiméricos purificados Ch2G3 e Ch4B5 foram finalmente obtidos.

Exemplo 4: Teste de afinidade e cinética de ligação in vivo

[00146] A afinidade para OX40 humano foi detectada em anticorpos murinos e anticorpos quiméricos (as etapas do método foram as mesmas que as descritas no Exemplo 2) e os resultados são mostrados na Figura 1A e na Figura 1B. m2G3- NC (-NC representa controle negativo), Ch2G3-NC, m4B5-NC e Ch4B5-NC foram controles negativos, que compartilham as mesmas regiões constantes usadas em m2G3, Ch2G3, m4B5 e Ch4B5, respectivamente, entretanto, as regiões variáveis do mesmo não reconhecem OX40.

[00147] Os resultados mostram que os anticorpos quiméricos Ch2G3 e Ch4B5 têm alta afinidade para OX40 humano.

Exemplo 5: Teste celular in vivo do gene repórter para anticorpo anti-OX40

[00148] A placa de poços foi revestida com anticorpo anti-CD3 (Chempartner, A05-001), colocada a 4 °C durante a noite e lavada 3 vezes com PBS; Células Jurkat-NF-Kb luc- hOX40 (ATCC, linha celular estável TIB-152 construída por Shanghai ChemPartner) e células Raji (ATCC, CCL-86) foram colhidas, ressuspensas e misturadas. 50 μl/poço do anticorpo diluído a ser testado e 50 μl/poço dos dois tipos de células misturados foram adicionados à placa, e a placa foi incubada a 37 °C em incubadora de 5% de CO2 por 5 horas. 100 μl de reagente de luciferase one-GloTM (Promega, Cat#E6120) foram adicionados a cada poço e incubados em temperatura ambiente por mais de 3 minutos. O sinal luminescente foi medido no instrumento, a leitura RLU foi registrada. Os resultados são mostrados na Tabela 3.

Tabela 3. Resultados da ativação in vivo do gene repórter por anticorpos anti-OX40 Anticorpo EC50 (nM) Ch2G3 0,6371 Ch4B5 0,5589

[00149] Os resultados mostram que os anticorpos quiméricos Ch2G3 e Ch4B5 podem efetivamente ativar o gene repórter.

Exemplo 6: Teste de humanização de anticorpo murino

[00150] De modo a reduzir a possível imunogenicidade, anticorpos murinos foram humanizados. A região variável da cadeia pesada (VH) e a região variável da cadeia leve (VL) do anticorpo quimérico foram respectivamente submetidas a mutações de aminoácidos direcionadas ao sítio na região de FR (região de framework). De acordo com diferentes combinações de mutações de aminoácidos, diferentes cadeias pesadas e cadeias leves de anticorpos humanizados foram projetadas, e plasmídeos que codificam diferentes combinações de cadeia leve/pesada foram transfectados em células para produzir anticorpos humanizados. Resumidamente, da seguinte forma: Em primeiro lugar, o vetor de expressão foi projetado: O vetor da cadeia pesada foi desenhado como segue: peptídeo sinal + sequência da região variável da cadeia pesada mutada + sequência da região constante da IgG1 humana.

[00151] O vetor de cadeia leve foi projetado da seguinte forma: peptídeo sinal + sequência da região variável da cadeia leve mutada + sequência da região constante Kappa humana.

[00152] As sequências acima foram inseridas separadamente no vetor pCEP4 (Thermofisher, V04450). Os vetores de expressão foram sintetizados por uma empresa de síntese de genes terceirizada de acordo com o projeto acima.

Após a obtenção do plasmídeo vetor, o plasmídeo foi extraído e enviado para sequenciamento para verificação. O plasmídeo qualificado foi transfectado em células 293F humanas com PEI e cultivadas continuamente, e as células 293F foram cultivadas em meio sem soro (Shanghai OPM biosciences, OPM- 293 CD03) para atingir a fase de crescimento logarítmico para transfecção celular. 21,4 μg do plasmídeo que codifica a cadeia leve do anticorpo humanizado e 23,6 μl do plasmídeo que codifica a cadeia pesada do anticorpo humanizado foram dissolvidos em 10ml de Meio de Soro Reduzido Opti-MEM®I (GIBCO, 31985-070) e bem misturados, então 200 μg PEI foi adicionado, e bem misturado, incubado em temperatura ambiente por 15 min, e adicionado a células de 50 ml.

[00153] Condições de cultura de células: 5% de CO2, 37 °C, 125 rpm/min. Durante o período de cultura, meio suplementar foi adicionado no dia 1 e no dia 3 até a viabilidade celular ser inferior a 70%, e o sobrenadante celular foi coletado e centrifugado. Após centrifugação e filtração, a solução de cultura celular foi carregada na coluna de afinidade para purificação do anticorpo, a coluna foi lavada com tampão fosfato, eluída com tampão glicina- ácido clorídrico (pH 2,7, 0,1 M Gly-HCl), neutralizada com ácido clorídrico Tris 1 M pH 9,0, e dialisado contra tampão fosfato, e anticorpos humanizados purificados foram finalmente obtidos.

[00154] As sequências das regiões variáveis humanizadas são como a seguir: >hu2G3 VH1

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSISRYSVHWVRQPPGKGLEWIGMIWDG

GNTDYNSALKSRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNPLYFSYAMDYWGQGT LVTVSS SEQ ID NO: 17; >hu2G3 VH2

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISRYSVHWIRQPPGKGLEWIGMIWDG

GNTDYNSALKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARNPLYFSYAMDYWGQGT LVTVSS SEQ ID NO: 18; >hu2G3 VL1

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPDQSPKLLIIYTSRL

QSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQVNTFPFTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 19; >hu2G3 VL2

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRL

QSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQVNTFPFTFGQGTKLEIK SEQ ID NO: 20.

[00155] Nota: O pedido é FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3- FR4, a sequência em itálico representa FR e a sequência sublinhada representa CDR.

[00156] As regiões variáveis projetadas do anticorpo humanizado foram combinadas em diferentes anticorpos como segue: Tabela 4. Anticorpo m2G3 humanizado e suas regiões variáveis de cadeia pesada e leve Anticorpo VH VL 2G3-hu1 hu2G3 VH1 hu2G3 VL1 2G3-hu2 hu2G3 VH2 hu2G3 VL1 2G3-hu3 hu2G3 VH1 hu2G3 VL2 2G3-hu4 hu2G3 VH2 hu2G3 VL2 Nota: 2G3-hu1 significa que a região variável da cadeia pesada do anticorpo humanizado 2G3-hu1 é hu2G3 VH1, a região variável da cadeia leve é hu2G3 VL1 e outros anticorpos podem ser interpretados de maneira semelhante.

[00157] As sequências das regiões variáveis humanizadas de m4B5 são como as seguintes: VL0 hu4B5:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKVPKLLIYYTSRL

HSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 21; VL1 hu4B5:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKVPKLLIYYTSRL

HSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 22; VL2 hu4B5:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGGVPKLLIYYTSRL

HSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 23;

VL3 hu4B5:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGGVPKLLIYYTSRL

HSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQQEDVATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 24; VL4 hu4B5:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGGTVKLLIYYTSRL

HSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYFCQQGNTLPWTFGGGTKVEIK SEQ ID NO: 25; VH0 hu4B5:

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGLHWIRQPPGKGLEWIGVIWSG

GSTDYNAAFISRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREEYDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 26; VH1 hu4B5:

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGLHWIRQPPGKGLEWIGVIWSG

GSTDYNAAFISRVTISKEDSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAREEYDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 27; VH2 hu4B5:

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGLHWIRQPPGKGLEWIGVIWSG

GSTDYNAAFISRVTISKEDSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCAREEYDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 28; VH3 hu4B5:

QVQLKESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGLHWFRQPPGKGLEWIGVIWSG

GSTDYNAAFISRVTISKEDSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCAREEYDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 29; VH4 hu4B5:

QVQLKESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGLHWFRQPPGKGLEWLGVIWSG

GSTDYNAAFISRLTISKEDSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCAREEYDVWGQGTTVTVSS SEQ ID NO: 30.

[00158] As regiões variáveis projetadas do anticorpo humanizado foram combinadas em diferentes anticorpos como segue: Tabela 5. Anticorpo humanizado m4B5 e as regiões variáveis de cadeia pesada e leve correspondentes do mesmo Região hu4B5 hu4B5 hu4B5 hu4B5 hu4B5 variável de VH0 VH1 VH2 VH3 VH4 cadeia leve/pesada hu4B5VL0 hu4B5- hu4B5- hu4B5- hu4B5- hu4B5- V1 V2 V3 V4 V5 hu4B5VL1 hu4B5- hu4B5- hu4B5- hu4B5- hu4B5- V6 V8 V9 V10 V11 hu4B5VL2 hu4B5- hu4B5- hu4B5- hu4B5- hu4B5- V15 V16 V17 V7 V12 hu4B5VL3 hu4B5- hu4B5- hu4B5- hu4B5- hu4B5- V18 V19 V20 V21 V13 hu4B5VL4 hu4B5- hu4B5- hu4B5- hu4B5- hu4B5- V22 V23 V24 V25 V14 Nota: Hu4B5 V1 significa que a região variável da cadeia pesada do anticorpo humanizado hu4B5 V1 é hu4B5 VH0, a região variável da cadeia leve é hu4B5 VL0 e outros anticorpos podem ser interpretados de maneira semelhante.

[00159] De modo a obter um anticorpo m2G3 modificado humanizado melhor, a sequência de aminoácidos de hu2G3 VH1 foi submetida a mutação. A sequência da região variável da cadeia pesada após a mutação é a seguinte: hu2G3 VH1.1

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSISRYSVHWVRQPPGKGLEWIGMIWDG GNTDYNAALKSRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNPLYFSYAMDYWGQGT

LVTVSS SEQ ID NO: 31; >hu2G3 VH1.2

QVQLQESGPGLVKPSQTLSLTCTVSGFSLSRYSVHWVRQPPGKGLEWIGMIWDGGNTDY AAPVKGRFTISRDDSKNTLYLQMNSLKTEDTAVYYCARNPLYFSYAMDYWGQGTLVTVS

S SEQ ID NO: 32.

[00160] A sequência HCDR2 obtida após a mutação é a seguinte: Tabela 6. Sequência HCDR2 obtida após mutação Nome Sequência SEQ ID NO HCDR2V1 MIWDGGNTDYNAALKS SEQ ID NO: 33 HCDR2V2 MIWDGGNTDYAAPVKG SEQ ID NO: 34

[00161] As regiões variáveis da cadeia pesada hu2G3 VH1.1 e hu2G3 VH1.2 foram combinadas com a região variável da cadeia leve hu2G3 VL para formar novos anticorpos humanizados otimizados, consultar Tabela 7.

Tabela 7. As regiões variáveis da cadeia leve/pesada do novo anticorpo hu2G3 humanizado obtido após a mutação

Anticorpo VH VL 2G3 hu2G3 VH1.1 hu2G3 VL1 2G3-hu5 hu2G3 VH1.1 hu2G3 VL2 2G3-hu6 hu2G3 VH1.2 hu2G3 VL1 2G3-hu7 hu2G3 VH1.2 hu2G3 VL2

[00162] Os anticorpos humanizados descritos acima foram testados quanto à afinidade (consulte o ELISA de captura no Exemplo 2) e os resultados do teste mostraram que as moléculas humanizadas podem se ligar a OX40.

[00163] Os resultados da avaliação de afinidade (ELISA de captura) para o m2G3 exemplificativo e o anticorpo humanizado do mesmo são mostrados na Tabela 8: Tabela 8. Afinidade de anticorpo Anticorpo m2G3 2G3- 2G3- 2G3-hu2 2G3-hu7 2G3- hu1 hu6 hu4 EC50 0,867 0,886 0,82 1,60 0,743 2,269 (μg/ml) Os resultados do teste de ELISA de captura para m4B5 exemplificativo e os anticorpos modificados do mesmo são mostrados na Tabela 9: Tabela 9. Afinidade de anticorpo Anticorpo m4B5 Ch4B5 hu4B5 hu4B5- hu4B5- hu4B5 -v1 v7 v10 -v14 EC50 0,58 0,208 0,59 0,254 0,76 0,536 (μg/ml)

[00164] A sequência da região variável da cadeia leve, conforme descrito acima, foi combinada com a sequência da região constante da cadeia leve para formar as sequências finais da cadeia leve, e a sequência da região variável da cadeia pesada, conforme descrito acima, foi combinada com a região constante da cadeia pesada para formar as sequências finais da cadeia pesada. As regiões constantes específicas da cadeia leve e pesada não estão limitadas às regiões constantes do anticorpo divulgadas na presente divulgação.

Outras regiões constantes de cadeia leve e pesada e mutantes das mesmas conhecidos na técnica também podem ser usados para aumentar o desempenho do anticorpo.

[00165] As regiões constantes exemplificativas são as seguintes: região constante de cadeia pesada IgG1:

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFP AVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCP APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQV YTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLY

SKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 35; região constante de cadeia leve kappa:

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQE SVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 36.

[00166] As sequências de aminoácidos dos anticorpos 2G3 e hu4B5-V7 exemplificativos (também conhecido como 4B5) de comprimento total são as seguintes: cadeia pesada 2G3:

QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGYSISRYSVHWVRQPPGKGLEWIGMIWDG GNTDYNAALKSRFTISRDNAKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARNPLYFSYAMDYWGQGT LVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTF PAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPC PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAK TKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQ VYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL

YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 37; cadeia leve 2G3:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPDQSPKLLIIYTSRL QSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQVNTFPFTFGQGTKLEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST

YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 38; cadeia pesada 4B5:

QVQLKESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLTSYGLHWFRQPPGKGLEWIGVIWSG GSTDYNAAFISRVTISKEDSKSQVSLKLSSVTAADTAVYYCAREEYDVWGQGTTVTVSS ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQS SGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELL GGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV

DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 39; cadeia leve 4B5:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGGVPKLLIYYTSRL HSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDVATYYCQQGNTLPWTFGGGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST

YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 40.

[00167] O controle positivo GPX4 foi preparado com referência a 1A7.gr.1 ensinado na patente nº WO2015153513, e as sequências de aminoácidos da cadeia pesada e leve das mesmas são as seguintes: cadeia pesada GPX4:

EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDSYMSWVRQAPGQGLEWIGDMYPD NGDSSYNQKFRERVTITRDTSTSTAYLELSSLRSEDTAVYYCVLAPRWYFSVWGQGTLV TVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPA VLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPA PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVY TLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS

KLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 41;

cadeia leve GPX4:

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSRL RSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQGHTLPPTFGQGTKVEIKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST

YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 42.

Exemplo 7: Teste de afinidade de ligação in vivo e cinética para anticorpo humanizado

[00168] O método Biacore é um método bem conhecido para detectar objetivamente a afinidade e a cinética entre as proteínas. Usamos Biacore T200 (GE) para analisar os anticorpos OX40 a serem testados da presente invenção, de modo a caracterizar a afinidade e a cinética de ligação.

[00169] Usando o kit fornecido pela Biacore, o anticorpo anti-OX40 recombinante a ser testado da presente invenção foi covalentemente conectado ao chip CM5 (GE) pelo método de acoplamento amino padrão NHS. Uma série de gradientes de concentração de proteína OX40-His humana (sinobiological#10481-H08H) diluída no mesmo tampão foi então carregada em cada ciclo a uma taxa de fluxo de 30 μl/min. Após o carregamento, o chip foi regenerado usando o reagente de regeneração fornecido no kit. A cinética de ligação antígeno-anticorpo foi traçada por 3 minutos, e a cinética de dissociação foi traçada por 10 minutos. Os dados resultantes foram analisados usando o software BIAevaluation

(GE) com modelo de ligação 1:1 (Langmuir). Os valores ka (kon), kd (koff) e KD dos anticorpos quiméricos determinados por este método são mostrados na tabela abaixo.

Tabela 10. Resultados mostrando afinidade de ligação in vivo de anticorpos humanizados Anticorpo a ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M) ser testado 2G3 4,371E+05 2,023E-03 4,628E-09 4B5 1,314E+05 3,694E-04 2,812E-09

[00170] Os resultados mostram que 2G3 e 4B5 podem se ligar efetivamente a OX40.

Exemplo 8: Teste de ELISA do bloqueio da ligação de OX40-OX40L por anticorpos

[00171] A placa de poço foi revestida com o ligante OX40 (Acrobiosystem, OXL-H52Q8), bloqueado, adicionado o anticorpo diluído em gradiente a ser testado (o anticorpo foi diluído em uma solução compreendendo Bio-OX40-FC humano (Acrobiosystem, OX40-H5255, marcado com biotina), pré- incubado por 40 minutos e, em seguida, adicionado à placa), incubado por 40 minutos e lavado. SA-HRP (Jackson Immunoresearch, 016-030-084) foi então adicionado e incubado durante 40 min. A solução reveladora e a solução de parada foram adicionadas e o valor de DO foi medido. Os resultados são mostrados na tabela abaixo.

Tabela 11. Resultados do teste de bloqueio da ligação de OX40-OX40L pelo anticorpo Anticorpo 2G3 4B5 IC50 (nM) 1,88 0,725

[00172] Os resultados mostram que 2G3 e 4B5 podem bloquear a ligação de OX40 a OX40L.

Exemplo 9: Dados de atividade de anticorpo humanizado

[00173] A placa de poço foi revestida com anticorpo anti-CD3 (Chempartner, A05-001), colocado a 4 °C durante a noite e lavado 3 vezes com PBS; Colheram-se células Jurkat- NF-Kb luc-hOX40 (ATCC, TIB-152, uma linha celular estável construída por Shanghai ChemPartner) e células Raji (ATCC, CCL-86). Os dois tipos de células foram ressuspensos e misturados. 50 μl/poço do anticorpo diluído a ser testado e 50 μl/poço dos dois tipos de células misturados foram adicionados à placa, e a placa foi incubada a 37 °C em incubadora de 5% de CO2 por 5 horas. O reagente de luciferase One-GloTM (Promega, Cat#E6120) foi adicionado a cada poço e incubado à temperatura ambiente por mais de 3 minutos. O sinal luminescente foi medido no instrumento, a leitura RLU foi registrada. Os resultados são mostrados na Tabela 12. Os resultados mostram que 2G3 e 4B5 podem efetivamente ativar o gene repórter.

Tabela 12. Resultados do teste de ativação do gene repórter por anticorpo humanizado

Anticorpo 2G3 4B5 EC50 (nM) 2,294 0,3411 Exemplo 10: Teste de função celular in vivo

[00174] Células T de memória CD4 + foram isoladas e adicionadas juntamente com o anticorpo a ser testado a uma placa de 96 poços revestida com anticorpo anti-CD3 (Chempartner, A05-001), co-incubada a 37 °C por 72 horas, o sobrenadante foi coletado para detectar IFN-γ. Os resultados são mostrados na Figura 2 e na Tabela 13. Os resultados mostram que GPX4, 4B5 e 2G3 podem aumentar significativamente a liberação de IFN-γ e 2G3 pode atingir o efeito de estimulação máximo a 10 ng/ml.

Tabela 13. Valores de IFNγ (pg/ml) correspondentes a diferentes anticorpos Concentração GPX 4B5 2G3 de anticorpo (ng/ml)

1.000 11.965 ± 783 14.286 ± 12.892 ±

1.893 1.648 100 18.261 ± 18.582 ± 269 16.345 ±

1.847 2.192 10 7.420 ± 305 12844 ± 21.604 ± 717

1.657 1 4.515 ± 7.413 ± 6.801 ± 333

1.145 1.149 0 2.126 ± 402 Nota: Os dados foram calculados da seguinte forma: média +/-

SEM (média +/- erro padrão da média), N = 3 (três repetições).

Exemplo 11: Inibição do crescimento de células tumorais por anticorpo anti-OX40

[00175] B-hTNFRSF4 (OX40) camundongos humanizados (B- hTNFRSF4 (OX40) camundongos humanizados, da Biocytogen Jiangsu Gene Biotechnology Co., Ltd.), fêmeas, 17 a 20 g, 6 a 7 semanas de idade.

[00176] As células tumorais MC38 7 na fase de crescimento logarítmico foram coletadas (adquiridas de Nanjing Yinhe Biomedicine Co., Ltd.), a concentração celular foi ajustada para 5 × 106/ml com tampão PBS e 0,1 ml de suspensão celular foi inoculada para os flancos de camundongos OX40. Os ratos foram monitorados após inoculação para o crescimento de tumores. No dia 7 após a inoculação, o volume médio do tumor no flanco de camundongos com tumor atingiu 102,5 mm3. Os camundongos foram divididos em grupos de acordo com o tamanho do tumor, administrados e monitorados. As informações de agrupamento são mostradas na Tabela 14.

Tabela 14. Agrupamento de camundongos e cronograma para dosagem de administração Grupo de Dosagem de Via de Frequência de administraç administração administra administração ão (mg/kg) ção

Controle 3 i.p. Q3Dx6 (IgG1) GPX4 3 i.p. Q3Dx6 2G3 0,3 i.p. Q3Dx6 2G3 1 i.p. Q3Dx6 2G3 3 i.p. Q3Dx6

[00177] O anticorpo humanizado OX40 foi testado quanto ao seu efeito inibitório no crescimento de xenoenxerto de células de câncer de cólon MC38 em camundongos.

[00178] Medição do volume do tumor e do peso de camundongos com tumor: o tumor foi medido duas vezes por semana usando um calibrador. O volume do tumor foi calculado de acordo com a fórmula: V = 0,5 a × b2, a e b representam o diâmetro longo e o diâmetro largo do tumor, respectivamente; TGI de xenoenxerto de crescimento de tumor (%) = [1- T/C] ×

100. O peso de todos os camundongos com tumor foi medido duas vezes por semana..

[00179] No dia 20 após a administração, o volume médio do tumor do grupo de controle de IgG1 atingiu 1.732,593 mm3; e o volume médio do tumor do grupo de administração de dose baixa do composto de teste 2G3 (0,3 mg/kg), grupo de administração de dose média (2G3, 1 mg/kg) e grupo de administração de dose alta (2G, 3 mg/kg) atingiu 930,37 mm3, 303,49 mm3 e 155,79 mm3, respectivamente. O grupo de dose média e alta inibiu significativamente o crescimento do tumor, quando comparado ao grupo controle (** P <0,01), e uma relação dose-dependente preliminar foi observada, com a taxa de inibição do crescimento do tumor de até 49%, 88% e 97,0%, respectivamente. O volume médio do tumor no grupo GPX4 de 3 mg/kg foi 362,47 mm3, o que foi significativamente diferente daquele do grupo de controle, e o grupo GPX4 de 3 mg/kg também mostrou inibição significativa do crescimento do tumor (* P <0,05), com a taxa de inibição do crescimento do tumor de até 84%.

[00180] O teste foi encerrado no dia 20 após a administração. Os resultados são mostrados na Tabela 15 e na Figura 3A e na Figura 3B. Todos os camundongos tratados foram sacrificados e a massa do xenoenxerto subcutâneo foi removida dos camundongos com tumor e pesada. O peso médio da massa tumoral no grupo controle foi de 1,568 g; quanto ao composto de teste 2G3 no grupo de dose baixa (0,3 mg/kg), grupo de dose média (1 mg/kg) e grupo de dose alta (3 mg/kg), o peso médio do tumor atingiu 0,926 g, 0,251 g e 0,181 g, respectivamente; o grupo de média e alta dose inibiu significativamente o crescimento tumoral, quando comparado ao grupo controle (** P <0,01). Enquanto isso, no grupo de administração de GPX4 (3 mg/kg), o peso médio do tumor foi de 0,372 g, o que foi significativamente diferente do grupo de controle, e o grupo de administração de GPX4 (3 mg/kg) também mostrou um efeito inibitório significativo sobre o crescimento de células tumorais MC38 (** P <0,01).

[00181] Durante o teste, não houve nenhuma anormalidade óbvia no peso corporal de todos os camundongos com tumor tratados. Ao mesmo tempo, não houve comportamentos anormais óbvios e outras manifestações durante o tratamento medicamentoso.

Tabela 15. Efeito antitumoral in vivo em camundongos 2G3 GPX4 IgG1 Dosagem (mg/kg) 0,3 1 3 3 - Volume tumoral (mm3) 930,3 303,4 155,7 362,4 1732,5 7 9 9 7 9 Peso tumoral (g) 0,926 0,251 0,181 0,372 1,568 Taxa inibitória 49 88 97 84 - tumoral(%)

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que: uma região variável de cadeia pesada compreende: I) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 3, 4 e 5 respectivamente; ou variantes de HCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença (ou diferenças) de aminoácidos quando comparadas com HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 3, 4 e 5 respectivamente; II) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 11, 12 e 13 respectivamente; ou variantes de HCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença (ou diferenças) de aminoácidos quando comparadas com HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 11, 12 e 13 respectivamente; III) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 11, 33 e 13 respectivamente; ou variantes de HCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença (ou diferenças) de aminoácidos quando comparadas com HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 11, 33 e 13 respectivamente; ou IV) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 11, 34 e 13 respectivamente; ou variantes de HCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença (ou diferenças) de aminoácidos quando comparadas com HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 11, 34 e 13 respectivamente; e/ou, uma região variável de cadeia leve compreende:

I) LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 6, 7 e 8 respectivamente; ou variantes de LCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença (ou diferenças) de aminoácidos quando comparadas com LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 6, 7 e 8 respectivamente; ou II) LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 14, 15 e 16 respectivamente; ou variantes de LCDR tendo 3, 2 ou 1 diferença (ou diferenças) de aminoácidos quando comparadas com LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NO: 14, 15 e 16 respectivamente; preferencialmente, o anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende: i) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NOs: 3, 4 e 5 respectivamente, e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NOs: 6, 7 e 8 respectivamente; ii) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NOs: 11, 12 e 13 respectivamente, e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NOs: 14, 15 e 16 respectivamente; iii) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NOs: 11, 33 e 13 respectivamente, e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NOs: 14, 15 e 16 respectivamente; ou iv) HCDR1, HCDR2 e HCDR3 como mostrado em SEQ ID NOs: 11, 34 e 13 respectivamente, e LCDR1, LCDR2 e LCDR3 como mostrado em SEQ ID NOs: 14, 15 e 16 respectivamente.

2. Anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é um anticorpo murino, anticorpo quimérico, anticorpo humano, anticorpo humanizado ou fragmento do mesmo.

3. Anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que: o fragmento de ligação ao antígeno é selecionado a partir do grupo que consiste em: Fab, Fab’, Fv, scFv, F(ab’)2 fragmento; a região variável de cadeia pesada do anticorpo compreende ainda regiões de framework de cadeia pesada derivadas de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana ou variante (ou variantes) das mesmas.

4. Anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, sendo que o anticorpo é caracterizado pelo fato de que compreende regiões constantes; preferencialmente, a região constante de cadeia pesada é derivada de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4 humana ou sequência mutante (ou sequências mutantes) da mesma; preferencialmente, a região constante de cadeia leve é derivada de cadeia kappa, lambda humana ou sequência mutante (ou sequências mutantes) da mesma; mais preferencialmente, a sequência de aminoácido da região constante de cadeia pesada é como mostrado em SEQ ID NO: 35 ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 35, mais preferencialmente, a sequência de aminoácido da região constante de cadeia leve é como mostrado em SEQ ID NO: 36 ou tendo pelo menos 90% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 36.

5. Anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que: a região variável de cadeia pesada compreende: I) uma sequência de aminoácido como mostrado em SEQ ID NO:1 ou tendo pelo menos 95% de identidade de sequência para SEQ ID NO:1; II) uma sequência de aminoácido como mostrado em SEQ ID NO: 9 ou tendo pelo menos 95% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 9; III) uma sequência de aminoácido como mostrado em qualquer uma das SEQ ID NO: 17, 18, 31 e 32; ou tendo pelo menos 95% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 17, 18, 31 ou 32; ou IV) uma sequência de aminoácido como mostrado em qualquer uma das SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29 e 30; ou tendo pelo menos 95% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29 ou 30;

e/ou, a região variável de cadeia leve compreende:

I) uma sequência de aminoácido como mostrado em SEQ ID

NO: 2 ou tendo pelo menos 95% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 2;

II) uma sequência de aminoácido como mostrado em SEQ ID

NO: 10 ou tendo pelo menos 95% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 10;

III) uma sequência de aminoácido como mostrado em qualquer uma das SEQ ID NO: 19 e 20; ou tendo pelo menos 95%

de identidade de sequência para SEQ ID NO: 19 ou 20;

IV) uma sequência de aminoácido como mostrado em qualquer uma das SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 e 25; ou tendo pelo menos 95% de identidade de sequência para SEQ ID NO:

21, 22, 23, 24 ou 25;

preferencialmente, o anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo compreende:

i) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 1, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 2;

ii) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 9 e uma região variável de cadeia leve como como mostrado em SEQ ID NO: 10;

iii) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 17 ou 18, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 19;

iv) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 17 ou 18, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 20; ou v) uma região variável de cadeia pesada como mostrado em qualquer uma das SEQ ID NO: 26, 27, 28, 29 e 30, e uma região variável de cadeia leve como mostrado em qualquer uma das SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 e 25.

6. Anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que compreende: i) uma cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 37 ou tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 37, e/ou, uma cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 38 ou tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 38; ou ii) uma cadeia pesada como mostrado em SEQ ID NO: 39 ou tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID NO: 39, e/ou uma cadeia leve como mostrado em SEQ ID NO: 40 ou tendo pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade de sequência para SEQ ID

NO: 40.

7. Anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, caracterizado pelo fato de que compete com o anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, pela ligação ao OX40 humano.

8. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que codifica o anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

9. Vetor que compreende o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 8, preferencialmente, sendo que o vetor é caracterizado pelo fato de que um vetor de expressão eucariótica, um vetor de expressão procariótica ou um vetor viral.

10. Célula hospedeira que compreende o vetor, conforme definido na reivindicação 9, sendo que, preferencialmente, a célula hospedeira é caracterizada pelo fato de que é selecionada a partir do grupo que consiste em: bactéria, levedura e célula de mamífero; mais preferencialmente, a célula hospedeira é selecionada a partir do grupo que consiste em: Escherichia coli, Pichia pastoris, célula de ovário de hamster Chinês e célula de rim embrionário humano 293.

11. Método para preparar o anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que compreende: cultivar a célula hospedeira, conforme definida na reivindicação 10; recuperar o anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo; opcionalmente, purificar o anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

12. Método para detectar ou medir OX40 caracterizado pelo fato de que compreende: uma etapa de contato do anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 com uma amostra.

13. Reagente caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

14. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende: uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz do anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7; e um ou mais portadores, diluentes, tampões ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

15. Método para tratar ou prevenir doença ou distúrbio, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz do anticorpo anti-OX40 ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou a composição farmacêutica, conforme definido na reivindicação 14, a um indivíduo; preferencialmente, a doença ou distúrbio é câncer; mais preferencialmente, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em: câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço, câncer esofágico, carcinoma gástrico, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer de bexiga, câncer cervical, câncer uterino, câncer ovariano, câncer de fígado, melanoma, câncer de rim, carcinoma de células escamosas, e câncer hematológico.

16. Método para aumentar resposta imune em um indivíduo humano, caracterizado pelo fato de que compreende: administrar uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz do anticorpo anti-OX40 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou a composição farmacêutica, conforme definido na reivindicação 14, a um indivíduo; preferencialmente, a resposta imune aumentada envolve a função imunoestimuladora/efetora aumentada de células efetoras T, e/ou a função imunossupressiva regulada para baixo de células reguladoras T.

17. Uso caracterizado pelo fato de que é de qualquer um selecionado a partir do seguinte na preparação de medicamento: - o anticorpo anti-OX40 ou o fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma da reivindicações 1 a 7, - o polinucleotídeo, conforme definido na reivindicação 8, - o vetor, conforme definido na reivindicação 9, - a composição farmacêutica, conforme definido na reivindicação 14; o medicamento é usado para tratar ou prevenir câncer, ou aumentar a resposta imune em um indivíduo humano; preferencialmente, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em: câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço, câncer esofágico, carcinoma gástrico, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer de bexiga, câncer cervical, câncer uterino, câncer ovariano, câncer de fígado, melanoma, câncer de rim,

carcinoma de células escamosas, e câncer hematológico.

18. Uso do anticorpo anti-OX40 ou do fragmento de ligação ao antígeno do mesmo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que é na preparação de um kit para detectar ou diagnosticar doença ou distúrbio relacionado à expressão de OX40; preferencialmente, a doença ou distúrbio é câncer; mais preferencialmente, o câncer é selecionado a partir do grupo que consiste em: câncer de pulmão, câncer de próstata, câncer de mama, câncer de cabeça e pescoço, câncer esofágico, carcinoma gástrico, câncer de cólon, câncer colorretal, câncer de bexiga, câncer cervical, câncer uterino, câncer ovariano, câncer de fígado, melanoma, câncer de rim, carcinoma de células escamosas, e câncer hematológico.