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BR112015006060B1 - Anticorpo monoclonal, composição farmacêutica e uso do anticorpo monoclonal - Google Patents

Anticorpo monoclonal, composição farmacêutica e uso do anticorpo monoclonal Download PDF

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BR112015006060B1
BR112015006060B1 BR112015006060-9A BR112015006060A BR112015006060B1 BR 112015006060 B1 BR112015006060 B1 BR 112015006060B1 BR 112015006060 A BR112015006060 A BR 112015006060A BR 112015006060 B1 BR112015006060 B1 BR 112015006060B1
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Laurent Gauthier
Simon Kollnberger
Benjamin Rossi
Hélène Sicard
Carine Paturel
Stéphanie Cornen
Stéphanie Zerbib
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Innate Pharma
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Publication date
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Abstract

AGENTES DE LIGAÇÃO KIR3DL2. A presente invenção diz respeito aos métodos para o tratamento de câncer e doenças inflamatórias usando anticorpos (por exemplo, anticorpos monoclonais), fragmentos de anticorpo, e seus derivados que especificamente ligam KIR3DL2. A invenção também diz respeito a anticorpos, células que produzem tais anticorpos; métodos de fabricar tais anticorpos; fragmentos, variantes, e derivados dos anticorpos; composições farmacêuticas que compreendem os mesmos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO
[0001] A presente invenção fornece proteínas de ligação de antígeno capazes de ligação aos polipeptídeos KIR3DL2. Os anticorpos têm atividade aumentada no tratamento de distúrbios caracterizados pelas células que expressam KIR3DL2, particularmente células T CD4+, incluindo malignidades tais como Micose Fungóide e Síndrome de Sezary, e distúrbios autoimunes que expressam KIR3DL2.
REFERÊNCIA CRUZADA PARA PEDIDOS RELACIONADOS
[0002] Este pedido reivindica os benefícios do Pedido Provisório U.S. No. 61/702.834, depositado em 19 de setembro de 2012; a divulgação do qual é aqui incorporada por referência na sua totalidade; incluindo quaisquer desenhos.
REFERÊNCIA À LISTAGEM DE SEQUÊNCIA
[0003] O presente pedido está sendo depositado junto com uma Listagem de Sequência no formato eletrônico. A Listagem de Sequência é fornecida como um arquivo intitulado "KIR-3 PCT_ST25", criado em 13 de setembro de 2013, que tem 91 KB no tamanho. A informação no formato eletrônico da Listagem de Sequência é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
FUNDAMENTOS
[0004] Os receptores das células matadoras semelhantes à imunoglobulina (KIR) são uma família de receptores que, juntos com os receptores da lectina tipo C (CD94-NKG2), são usados pelas células NK humanas e subconjuntos de linfócito T para especificamente reconhecer moléculas de MHC de classe I. Certos KIR inibidores e ativadores têm domínios extracelulares altamente similares e são reconhecidos pelo mesmo anticorpo monoclonal, por exemplo, KIR2DL1 e KIR2DS1 são ambos reconhecidos pelo EB6, e 2DL2 e 2DS2 pelo GL183. Três critérios (número de domínios extracelulares semelhantes à IgG (domínios D0, D1, D2), comprimento da cauda citoplásmica, e analogia de sequência) foram usados para categorizar as proteínas KIR em 13 grupos, a saber KIR3DL1-2, KIR3DS1, KIR2DL1-5, e KIR2DS1-5. A nomenclatura 2D para 2 domínios ou 3D para 3 domínios dá o número de domínios semelhantes à IgG; receptores com domínios citoplásmicos longo ou curto são classificados ainda como L ou S. (Pascal V. et al., 2007 J. Immunol. 179: 1625-1633). Os receptores inibidores possuem caudas citoplásmicas longas (L) (isto é, KIR2DL ou KIR3DL) contendo um ITIM canônico que se torna fosforilado na tirosina no envolvimento com KIR dos seus ligandos de HLA classe I. O ITIM fosforilado recruta a fosfatase 1 contendo domínio 2 de homologia a Src das proteína tirosina fosfatases contendo o domínio 2 de homologia a Src e/ou fosfatase 2 contendo domínio 2 de homologia a Src, que desfosforilam substratos celulares, anulando assim o sinal de ativação de NK, isto é, células alvo escassas com auto- expressão MHC classe I apropriada. Receptores com caudas citoplásmicas curtas (S) carecem de ITIMs (isto é, KIR2DS ou KIR3DS). Estes ativadores KIR contêm um resíduo carregado dentro do seu domínio de transmembrana que facilita a interação com a cadeia de sinalização KARAP/DAP12. O envolvimento da família KIR2DS de receptores foi mostrada levar a uma cascata de eventos de sinalização mediados por KARAP/DAP12 culminando na atividade citolítica de célula NK aumentada e na produção de citocinas pró-inflamatórias tais como IFN-71 (Pascal et al. 2007) J. Immunol. 179: 1625-1633). As células NK maduras são prognosticadas adquirir pelo menos um receptor inibidor específico para uma auto-molécula de MHC classe I, que geralmente de modo funcional prevalece sobre as moléculas ativadoras potencialmente auto-reativas. É proposto que a resposta das células NK representa o resultado integrado tanto de ativadores quanto de inibidores sinalizando pelo KIR e outros receptores.
[0005] KIR3DL2 foi estudado como um alvo para o tratamento de malignidades envolvendo células T CD4+ que expressam receptores de KIR3DL2, particularmente células T CD4+, incluindo malignidades tais como Micose Fungóide e Síndrome de Sezary (ver, por exemplo, as publicações PCT WO2010/081890 e WO02/50122).
[0006] Um ligando de KIR3DL2, HLA-B27, está fortemente associado com a Espondiloartrite (SpA) um grupo de distúrbios artríticos inflamatórios debilitantes tipificados pela Espondilite Anquilosante (AS). Estudos de associação ampla de genoma têm fortemente implicado genes envolvidos na regulagem de IL-17 produzida pelas células Th17 em SpA (Reveille, et al. (2011) Nat Genet 43: 761-767.). A IL17 foi implicada em diversos distúrbios autoimunes incluindo SpA (Shen, et al. (2009) Arthritis Rheum 60: 1647-1656; Wendling, et al. (2007) Joint Bone Spine 74: 304-305). HLA-B27 (B27) é expressado na superfície de células que expressam antígeno (APC) em doenças tanto como heterotrímeros associados com 2m clássicos quanto como dímeros de cadeia pesada ligados a dissulfeto isentos de 2m não canônicos (chamados de B272) (Bird, et al. (2003) Eur J Immunol 33: 748-759; Kollnberger, et al. (2002) Arthritis Rheum 46: 2972-2982). Os dímeros B27 mas não os heterotrímeros B27 são ligandos para o receptor de célula matadora semelhante à imunoglobulina KIR3DL2 (Kollnberger et al. (2002)). Os três domínios semelhantes à imunoglobulina D0, D1 e D2 de KIR3DL2 estão envolvidos em ligando de ligação. A LIGAÇÃO KIR3DL2 pelos dímeros B27 promove a sobrevivência de subconjuntos de célula Th17 e NK (Bowness, et al. (2011) Journal of immunology 186: 2672-2680; Chan, et al. (2005) Arthritis Rheum 52: 3586-3595). Foi mostrado que existem proporções aumentadas de subconjuntos de célula Th17 e NK patogênicos que expressam KIR3DL2 em pacientes com SpA Bowness et al. (2011) e Chan et al. (2005). Estudos fortemente sugerem que as interações de KIR3DL2-B27 têm um papel central a desempenhar em SpA e que KIR3DL2 é um alvo terapêutico promissor.
[0007] A existência de anticorpos reativos contra vários polipeptídeos KIR3D foi relatada. A existência de dois anticorpos anti-KIR3DL2 foi relatada: Q241 e Q66 (Pende, et al. (1996) J Exp Med 184: 505-518). Entretanto, estes dois anticorpos são do isótipo IgM (pentâmeros) e não são facilmente adaptados para uso farmacêutico; além disso, se suas regiões variáveis foram colocadas no contexto de um anticorpo tipo IgG bivalente, a sua afinidade seria esperada ser baixa. As células aludidas como “AZ158” que produzem um outro anticorpo foram relatadas (Parolini, S., et al. (2002) In Leucocyte typing VII. D. Mason, editor. Oxford University Press, Oxford. 415-417; publicação PCT WO2010/081890).Anticorpo 5,133 está disponível da Miltenty Biotech (Auburn CA). Ambos os anticorpos AZ158 e 5,133 ligam KIR3DL2 assim como KIR3DL1 (e ainda o KIR3DS1 altamente homólogo). KIR3DL2 e KIR3DL1 compartilham identidade de aminoácido relativamente alta e vários ligandos de HLA que ligam KIR3DL2 também são reconhecidos pelo KIR3DL1. A despeito das imunizações que dão origem a AZ158, Q241 e Q66, existe uma necessidade quanto a anticorpos melhorados nas aplicações terapêuticas e outras.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0008] Em um aspecto, a presente invenção resulta, inter alia, da descoberta de que KIR3DL2 pode internalizar quando ligado a um anticorpo. Nós pelo nosso lado identificamos uma faixa de mAbs anti-KIR3DL2 que não internalizam. É demonstrado que a internalização de KIR3DL2 fortemente dificultar métodos com base em ADCC. Aqui nós também fornecemos anticorpos anti-KIR3DL2 que inibem as interações diméricas de B27 com KIR3DL2. Novamente, o bloqueio de ligando pode ser obtido sem causar a internalização de receptor. Nós também fornecemos anticorpos que seletivamente bloqueiam as interações de KIR3DL2- HLA B27 sem bloquear as interações de KIR3DL2-HLA-A3.
[0009] São fornecidos anticorpos que ligam os alelos principais de KIR3DL2 (em termos de frequências nas populações humanas), embora sem ligação ao polipeptídeo KIR3DL1 intimamente relacionado (por exemplo, alelo *00101 que compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 169). Em uma forma de realização, os anticorpos ligam-se a 1, 2, 3, 4 ou 5 ou mais dos polipeptídeos KIR3DL2 (por exemplo, alelos *002, *003, *005, *007, e/ou *008) das SEQ ID NOS: 1 e 159 a 168. Consequentemente, são fornecidos anticorpos tendo as propriedades funcionais vantajosas aqui descritas, e que podem ser administradas para o tratamento de doença substancialmente através da população humana, por exemplo, sem a necessidade de conduzir testes de diagnóstico para avaliar o alelo de KIR3DL2 expressado em um indivíduo.
[0010] Também são fornecidas, através do estudo de epítopos dos anticorpos, regiões no KIR3DL2 (no domínio D0 e domínio D2) que podem ser alvejadas pelos anticorpos para dar origem a propriedades vantajosas.
[0011] Em um aspecto, os anticorpos além disso têm a vantagem adicional de ligação aos alelos múltiplos de KIR3DL2 humano enquanto mantêm a especificidade de KIR3DL2 em relação ao KIR3DL1.
[0012] São fornecidos anticorpos que têm a vantagem de bloquear ligandos naturais de KIR3DL2 e que são assim bem adaptados para tratar ou prevenir distúrbios inflamatórios, como uma formato de mAb esgotado ou não esgotado. Além disso, epítopos diferentes fornecem especificidade de bloqueio de ligando diferente.
[0013] Também são fornecidos anticorpos, incluindo anticorpos não internalizantes, que não bloqueiam os ligandos de KIR3DL2 (HLA-A3 e HLA- B27); Estes anticorpos podem ser vantajosos em métodos com base em ADCC onde pode ser útil evitar a competição com ligandos.
[0014] Em uma forma de realização, é fornecido um anticorpo que liga um polipeptídeo KIR3DL2, em que o dito anticorpo não se liga substancialmente a um polipeptídeo KIR3DL1 (por exemplo, em que o polipeptídeo KIR3DL1 compreende uma sequência de aminoácido da SEQ ID NO: 169), e em que o dito anticorpo não é internalizado dentro de células que expressam KIR3DL2.
[0015] Em uma forma de realização, é fornecido um anticorpo que se liga a pelo menos dois polipeptídeos KIR3DL2 (alelos), e em que o dito anticorpo não se liga substancialmente a um polipeptídeo KIR3DL1 (por exemplo, KIR3DL1 alelo *00101 que compreende a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 169).
[0016] Em uma forma de realização, os anticorpos se ligam a 1, 2, 3, 4 ou 5 dos polipeptídeos KIR3DL2 (alelos *002, *003, *005, *007, e/ou *008) das SEQ ID NOS: 1, 161, 163, 165 e/ou 166.
[0017] Em uma forma de realização, os anticorpos se ligam a cada um dos polipeptídeos KIR3DL2 tendo a sequência de aminoácido mostrada nas SEQ ID NOS: 1, 171 e 176 (alelos_*002, *001 e *007, respectivamente). Em uma forma de realização, os anticorpos se ligam a cada um dos polipeptídeos KIR3DL2 tendo a sequência de aminoácido mostrada nas SEQ ID NOS: 171 e 178 (alelos_*001 e *009, respectivamente). Em uma forma de realização, os anticorpos se ligam a cada um dos polipeptídeos KIR3DL2 tendo a sequência de aminoácido mostrada nas SEQ ID NOS: 171, 1, 176 e 178 (alelos_*001, *002, *007 e *009, respectivamente). Em uma forma de realização, os anticorpos se ligam a cada um dos polipeptídeos KIR3DL2 tendo a sequência de aminoácido mostrada nas SEQ ID NOS: 171, 1, 172, 174 e 176 (alelos_*001, *002, *003, *005 e *007, respectivamente). Em uma forma de realização, os anticorpos se ligam a cada um dos polipeptídeos KIR3DL2 tendo a sequência de aminoácido mostrada nas SEQ ID NOS: 171, 1, 176 e 177 (alelos_*001, *002, *007 e *008, respectivamente). Em uma forma de realização, os anticorpos se ligam a cada um dos polipeptídeos KIR3DL2 tendo a sequência de aminoácido mostrada nas SEQ ID NOS: 171, 1, 172, 174, 176 e 177 (alelos_*001, *002, *003, *005, *007 e *008, respectivamente). Em uma forma de realização de qualquer uma das precedentes, os anticorpos ligam ainda um polipeptídeo KIR3DL2 tendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 178 (alelo *09). Em uma forma de realização de qualquer uma das precedentes, os anticorpos ligam ainda um polipeptídeo KIR3DL2 tendo a sequência de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 173 (alelo *004). Em uma forma de realização de qualquer uma das precedentes, os anticorpos ligam ainda um polipeptídeo KIR3DL2 alelo *010 (tendo o mesmo domínio extracelular da SEQ ID NO: 171 como *001). Em uma forma de realização de qualquer uma das precedentes, os anticorpos ligam ainda um polipeptídeo KIR3DL2 alelo *011 (tendo o mesmo domínio extracelular (da SEQ ID NO: 179) como *003). Em uma forma de realização de qualquer uma das precedentes, os anticorpos ligam ainda um polipeptídeo KIR3DL2 alelo *006. Opcionalmente, em cada caso, o anticorpo se liga ao dito polipeptídeo KIR3DL2 expressado na superfície de uma célula (por exemplo, uma linhagem de célula repórter, em que KIR3DL2 está na conformação nativa). Opcionalmente o anticorpo liga um epítopo conformacional.
[0018] Opcionalmente, em cada caso, o anticorpo se liga ao dito polipeptídeo KIR3DL2 expressado na superfície de uma célula com afinidade de ligação (KD), opcionalmente em que a afinidade de ligação é bivalente, para um polipeptídeo KIR3DL2 humano de menos do que 10-8 M. Preferivelmente o anticorpo liga um epítopo conformacional no KIR3DL2.
[0019] Em uma forma de realização, é fornecido um anticorpo que se liga a um resíduo de aminoácido nos domínios D0 ou D2 de um polipeptídeo KIR3DL2, e em que o dito anticorpo não se liga substancialmente a um polipeptídeo KIR3DL1.
[0020] Opcionalmente, o anticorpo tem afinidade de ligação (KD), opcionalmente em que a afinidade de ligação é bivalente, para um polipeptídeo KIR3DL2 humano de menos do que (isto é, afinidade menor do que) 10-8 M, preferivelmente menor do que 10-9 M, ou preferivelmente menor do que 10-10 M.
[0021] Opcionalmente, os anticorpos têm um EC50 de não mais do que 5 μg/ml, opcionalmente não mais do que 3 μg/ml, não mais do que 2 μg/ml, não mais do que 1 μg/ml ou não mais do que 0,5 μg/ml para ligação às células feitas para expressar na sua superfície um alelo de KIR3DL2 particular (por exemplo, alelos_*001, *002, *003, *005, *007 e/ou *008).
[0022] Em um aspecto são fornecidos anticorpos que ligam o polipeptídeo KIR3DL2 na região de ligação de ligando (HLA) (por exemplo, bolsa de ligação de HLA) ou pelo menos parcialmente na face de ligação de HLA da proteína KIR3DL2.
[0023] Preferivelmente, em qualquer uma das formas de realização aqui, é fornecido um anticorpo que se liga a um resíduo de aminoácido dentro do domínio D0 (resíduos 1 a 98 da SEQ ID NO: 1) e/ou do domínio D2 (resíduos de 193 a 292 da SEQ ID NO: 1) de um polipeptídeo KIR3DL2. Opcionalmente, a ligação do anticorpo a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação em um resíduo dentro do domínio D0 e/ou D2 é substancialmente reduzida, em comparação à ligação a um polipeptídeo KIR3DL2 do tipo selvagem da SEQ ID NO: 1.
[0024] Em um aspecto, os anticorpos ligam um epítopo que compreende um, dois, três, quatro, cinco ou mais dos resíduos selecionados do grupo consistindo de: R13, P14, S15, H23, A25, Q27, 160 e G62 (com referência à SEQ ID NO: 1), e/ou os anticorpos têm ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação em um resíduo selecionado do grupo consistindo de: R13, P14, S15, H23, A25, Q27, 160 e G62 (com referência à SEQ ID NO: 1).
[0025] A notação abreviada usada para as mutações aqui é: resíduo do tipo selvagem: posição no polipeptídeo, com a numeração de resíduos como indicada na SEQ ID NO: 1: resíduo mutante.
[0026] Em um aspecto são fornecidos anticorpos que ligam um epítopo que compreende os resíduos R13, A25 e/ou Q27 do polipeptídeo KIR3DL2, e/ou têm ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação nos resíduos R13, A25 e/ou Q27 (com referência à SEQ ID NO: 1). Por exemplo, um anticorpo pode ter ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo as mutações R13W, A25T e/ou Q27R. Opcionalmente, o epítopo adicionalmente compreende um ou mais dos resíduos I60 e/ou G62 (com referência à SEQ ID NO: 1), e/ou os anticorpos têm ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação no resíduos I60 e/ou G62 (com referência à SEQ ID NO: 1, por exemplo, I60N, G62S). Opcionalmente, o epítopo adicional ou alternativamente compreende um ou mais dos resíduos P14, S15 e/ou H23 (com referência à SEQ ID NO: 1), e/ou os anticorpos têm ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação no resíduos P14, S15 e/ou H23 (com referência à SEQ ID NO: 1, por exemplo, P14S, S15A, H23S). Opcionalmente, o epítopo não compreende os resíduos R32 e/ou G33 (com referência à SEQ ID NO: 1), e/ou os anticorpos não têm ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação nos resíduos R32 e/ou G33 (com referência à SEQ ID NO: 1, por exemplo, R32H e/ou G33R). Opcionalmente, o epítopo não compreende os resíduos F50 e/ou R53 (com referência à SEQ ID NO: 1), e/ou os anticorpos não têm ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação nos resíduos F50 e/ou R53 (com referência à SEQ ID NO: 1, por exemplo, F50A, R53S). O anticorpo pode ligar-se (por exemplo, anticorpos que bloqueiam as interações KIR3DL2- HLA B27 e -HLA A3) ou não (por exemplo, anticorpos não internalizantes) aos resíduos Q56 e/ou E57, e/ou resíduos F9 e/ou S11; assim, em uma forma de realização, opcionalmente, o epítopo não compreende os resíduos F9, S11, Q56 e/ou E57 (com referência à SEQ ID NO: 1), e/ou os anticorpos não têm ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação nos resíduos F9, S11, Q56 e/ou E57 (com referência à SEQ ID NO: 1, por exemplo, F9S e S11A, Q56S e E57A); em uma outra forma de realização, opcionalmente, o epítopo compreende os resíduos F9, S11, Q56 e/ou E57 (com referência à SEQ ID NO: 1), e/ou os anticorpos têm ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação nos resíduos F9, S11, Q56 e/ou E57 (com referência à SEQ ID NO: 1, por exemplo, F9S e S11A, Q56S e E57A). Opcionalmente, o epítopo não compreende os resíduos H29 e/ou F34 (com referência à SEQ ID NO: 1), e/ou os anticorpos não têm ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação nos resíduos H29 e/ou F34 (com referência à SEQ ID NO: 1, por exemplo, H29S, F34A). Opcionalmente, o epítopo não compreende um ou mais dos resíduos F9 e/ou S11 (com referência à SEQ ID NO: 1), e/ou os anticorpos não têm ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação nos resíduos F9 e/ou S11 (com referência à SEQ ID NO: 1, por exemplo, F9S, S11A).
[0027] Em um aspecto são fornecidos anticorpos que ligam um epítopo que compreende os resíduos I60 e/ou G62 do polipeptídeo KIR3DL2 da SEQ ID NO: 1, e/ou têm ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação nos resíduos I60 e/ou G62 (com referência à SEQ ID NO: 1). Por exemplo, um anticorpo pode ter ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo as mutações I60N e/ou G62S. Opcionalmente, o epítopo adicional ou alternativamente compreende um ou mais dos resíduos P14, S15 e/ou H23 (com referência à SEQ ID NO: 1), e/ou os anticorpos têm ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação nos resíduos P14, S15 e/ou H23 (com referência à SEQ ID NO: 1, por exemplo, P14S, S15A, H23S). Opcionalmente, os anticorpos não ligam os resíduos R13, A25 e/ou Q27 do polipeptídeo KIR3DL2, e/ou não têm ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação nos resíduos R13, A25 e/ou Q27 (por exemplo, um polipeptídeo KIR3DL2 tendo as mutações R13W, A25T e/ou Q27R).
[0028] Em um aspecto são fornecidos anticorpos que ligam um epítopo que compreende os resíduos P14, S15 e/ou H23 do polipeptídeo KIR3DL2 da SEQ ID NO: 1, e/ou têm ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação nos resíduos P14, S15 e/ou H23 (com referência à SEQ ID NO: 1, por exemplo, P14S, S15A, H23S).
[0029] Em um aspecto, são fornecidos anticorpos que têm ligação reduzida a (1) um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação nos resíduos I60 e/ou G62 (com referência à SEQ ID NO: 1, por exemplo, I60N, G62S), e (2) um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação nos resíduos P14, S15 e/ou H23 (com referência à SEQ ID NO: 1, por exemplo, P14S, S15A, H23S).
[0030] Em um aspecto, são fornecidos anticorpos que ligam um epítopo que compreende: (a) 1, 2 ou 3 dos resíduos R13, A25 e/ou Q27 e (b) um ou ambos dos resíduos I60 e/ou G62 do polipeptídeo KIR3DL2. Em um aspecto, os anticorpos têm ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo: (a) uma mutação em 1, 2 ou 3 dos resíduos R13, A25 e/ou Q27, e (b) uma mutação em um ou ambos dos resíduos I60 e/ou G62.
[0031] Em um aspecto, são fornecidos anticorpos que ligam um epítopo que compreende os resíduos R78 e/ou L82 do polipeptídeo KIR3DL2 da SEQ ID NO: 1, e/ou têm ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação nos resíduos R78 e/ou L82 (com referência à SEQ ID NO: 1). Por exemplo, um anticorpo pode ter ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo as mutações R78H e L82P.Opcionalmente, o epítopo adicionalmente compreende, ou exclui, um ou mais dos resíduos K7, Y30, R31, P79, H80, S81, T83, G84, W85, S86 e/ou A87 (com referência à SEQ ID NO: 1), e/ou os anticorpos têm ligação reduzida ou não tem ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação nos resíduos K7, Y30, R31, P79, H80, S81, T83, G84, W85, S86 e/ou A87 (com referência à SEQ ID NO: 1). Em uma forma de realização, os anticorpos ligam um epítopo que compreende 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais resíduos no segmento que corresponde aos resíduos de 1 a98 do polipeptídeo KIR3DL2 (com referência à SEQ ID NO: 1), opcionalmente ainda em que o epítopo compreende um ou mais (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5) dos resíduos K7, Y30, R31, R78, P79, H80, S81, L82, T83, G84, W85, S86 e/ou A87.
[0032] Em um aspecto, são fornecidos anticorpos que ligam um epítopo que compreende os resíduos W226 do polipeptídeo KIR3DL2 da SEQ ID NO: 1, e/ou têm ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação nos resíduos W226 (com referência à SEQ ID NO: 1). Opcionalmente, o epítopo adicionalmente compreende um ou mais dos resíduos I231 e/ou R246 (com referência à SEQ ID NO: 1), e/ou os anticorpos têm ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação nos resíduos I231 e/ou R246 (com referência à SEQ ID NO: 1, por exemplo, I231M, R246P). Opcionalmente, o epítopo adicionalmente compreende o resíduo E239 (com referência à SEQ ID NO: 1), e/ou os anticorpos têm ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação no resíduo E239 (com referência à SEQ ID NO: 1, por exemplo, E239G).
[0033] Em um aspecto, são fornecidos anticorpos que ligam um epítopo que compreende os resíduos I231 e/ou R246 do polipeptídeo KIR3DL2 da SEQ ID NO: 1, e/ou têm ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação nos resíduos I231 e/ou R246 (com referência à SEQ ID NO: 1).
[0034] Em um aspecto, são fornecidos anticorpos que ligam um epítopo que compreende o resíduo W226 e um ou ambos dos resíduos I231 e/ou R246 do polipeptídeo KIR3DL2.
[0035] Em um aspecto, os anticorpos têm ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação nos resíduos W226 e uma mutação em um ou ambos dos resíduos I231 e/ou R246.
[0036] Em qualquer forma de realização aqui, o anticorpo opcionalmente não causa a internalização de polipeptídeos KIR3DL2 nas células que expressam KIR3DL2 e/ou não é internalizado nas células que expressam KIR3DL2.
[0037] Em uma forma de realização, é fornecido um anticorpo que liga um polipeptídeo KIR3DL2, em que o dito anticorpo reduz (ou elimina) detectavelmente a ligação entre o KIR3DL2 e um primeiro ligando natural HLA de KIR3DL2 mas não reduz detectavelmente (ou elimina) a ligação entre o KIR3DL2 e um segundo ligando natural HLA de KIR3DL2.
[0038] Em uma forma de realização, o anticorpo opcionalmente detectavelmente reduz a ligação entre o KIR3DL2 e um ligando HLS de classe I de KIR3DL2 (por exemplo, HLA-B27, HLA-A3, HLA-B7, HLA-B35 e/ou HLA-A2).
[0039] Em uma forma de realização, o anticorpo opcionalmente de modo detectável reduz a ligação entre o KIR3DL2 e HLA-B27 mas não reduz detectavelmente a ligação entre KIR3DL2 e HLA-A3.
[0040] Em uma forma de realização, o anticorpo opcionalmente de modo detectável reduz a ligação entre o KIR3DL2 e HLA-A3 mas não reduz detectavelmente a ligação entre KIR3DL2 e HLA-B27.
[0041] Em uma forma de realização, o anticorpo opcionalmente não reduz detectavelmente a ligação entre o KIR3DL2 e HLA-B27, ou entre KIR3DL2 e HLA-A3.
[0042] Em uma forma de realização, o anticorpo opcionalmente liga pelo menos dois polipeptídeos KIR3DL2 (alelos) tendo sequências de aminoácido diferentes.
[0043] Em uma forma de realização, o anticorpo opcionalmente não se liga substancialmente a um polipeptídeo KIR3DL1.
[0044] Nas formas de realização aqui para os anticorpos que bloqueiam ligando e/ou para os anticorpos que ligam um epítopo que compreende os resíduos H32 e/ou G33 do polipeptídeo KIR3DL2, o anticorpo pode opcionalmente causar a internalização de polipeptídeos KIR3DL2 em células que expressam KIR3DL2 e/ou é internalizado dentro das células que expressam KIR3DL2.
[0045] Um anticorpo anti-KIR3DL2 pode ser útil para o tratamento de cânceres, distúrbios inflamatórios e distúrbios autoimunes, por exemplo, em indivíduos humanos. Este anticorpo pode ser usado com ou sem ligação a um agente tóxico ou outro, dependendo do efeito desejado ou uso feito dos anticorpos. Em uma forma de realização, o anticorpo anti-KIR3DL2 é um “anticorpo nu” e não é ligado a um agente tóxico. Em uma forma de realização, um anticorpo nu ou ligado compreende uma cadeia pesada que compreende uma região Fc (por exemplo, IgG1) que liga receptores Fcy (por exemplo, CD16). Opcionalmente em que tal anticorpo induz citotoxicidade dependente de complemento (CDC) e/ou citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) para uma célula que expressa KIR3DL2.
[0046] Opcionalmente, em qualquer forma de realização, o anticorpo (por exemplo, IgG4, IgG1, fragmento de anticorpo, etc.) compreende ainda um agente tóxico (por exemplo, um agente quimioterapêutico) que é tóxico a uma célula na internalização do conjugado de anticorpo-toxina. Em uma forma de realização o anticorpo é conjugado a um agente radioativo.
[0047] A presente divulgação fornece ainda anticorpos, fragmentos de anticorpo, e derivados que especificamente ligam KIR3DL2 humano. A divulgação fornece tais composições de anticorpo, assim como o seu uso em qualquer um dos métodos aqui divulgados de tratar, prevenir e diagnosticar câncer, distúrbios inflamatórios ou distúrbios autoimunes.
[0048] Em uma forma de realização, os anticorpos têm afinidade de ligação (KD) para um polipeptídeo KIR3DL2 humano de menos do que 10-8 M, preferivelmente menos do que 10-9 M, ou preferivelmente menos do que 10-10M. Opcionalmente, a afinidade refere-se à ligação bivalente.
[0049] Em um aspecto de qualquer uma das formas de realização aqui, o anticorpo pode ter uma cadeia pesada e/ou leve tendo um, dois ou três CDRs da respectiva cadeia pesada e/ou leve de um anticorpo selecionado do grupo consistindo dos anticorpos 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 e/ou 20E9.
[0050] Em um aspecto de qualquer uma das formas de realização aqui, o anticorpo compete quanto à ligação a um polipeptídeo KIR3DL2 com qualquer uma ou qualquer combinação de anticorpos monoclonais 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 e/ou 20E9. Em uma forma de realização, um anticorpo compete quanto à ligação a um polipeptídeo KIR3DL2, com um anticorpo selecionado do grupo consistindo de:
[0051] Em um aspecto a divulgação fornece um anticorpo monoclonal que especificamente liga KIR3DL2 selecionado do grupo consistindo de: (a) um anticorpo tendo (i) uma cadeia pesada que compreende a CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que compreende uma sequência das SEQ ID NOS: 4, 5 ou 6 (HCDR1), SEQ ID NOS: 7 ou 8 (HCDR2) e SEQ ID NO: 9 (HCDR3) respectivamente, e (ii) uma cadeia leve que compreende a CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que compreende uma sequência da SEQ ID NO: 10, 11 ou 12, respectivamente, em que cada CDR pode opcionalmente compreender 1, 2, 3 ou 4 substituições, deleções ou inserções de aminoácido; (b) um anticorpo tendo (i) uma cadeia pesada que compreende a CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que compreende uma sequência das SEQ ID NOS: 15, 16 ou 17 (HCDR1), SEQ ID NOS: 18 ou 19 (HCDR2) e SEQ ID NO: 20 (HCDR3) respectivamente, e (ii) uma cadeia leve que compreende a CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que compreende uma sequência da SEQ ID NO: 10, 21 ou 22, respectivamente, em que cada CDR pode opcionalmente compreender 1, 2, 3 ou 4 substituições, deleções ou inserções de aminoácido; (c) um anticorpo tendo (i) uma cadeia pesada que compreende a CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que compreende uma sequência das SEQ ID NOS: 25, 26 ou 27 (HCDR1), SEQ ID NOS: 28 ou 29 (HCDR2) e SEQ ID NO: 30 (HCDR3) respectivamente, e (ii) uma cadeia leve que compreende a CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que compreende uma sequência da SEQ ID NO: 31, 32 ou 33, respectivamente, em que cada CDR pode opcionalmente compreender 1, 2, 3 ou 4 substituições, deleções ou inserções de aminoácido; (d) um anticorpo tendo (i) uma cadeia pesada que compreende a CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que compreende uma sequência das SEQ ID NOS: 36, 37 ou 38 (HCDR1), SEQ ID NOS: 39 ou 40 (HCDR2) e SEQ ID NO: 41 (HCDR3) respectivamente, e (ii) uma cadeia leve que compreende a CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que compreende uma sequência da SEQ ID NO: 42, 43 ou 44, respectivamente, em que cada CDR pode opcionalmente compreender 1, 2, 3 ou 4 substituições, deleções ou inserções de aminoácido; (e) um anticorpo tendo (i) uma cadeia pesada que compreende a CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que compreende uma sequência das SEQ ID NOS: 47, 48 ou 49 (HCDR1), SEQ ID NOS: 50 ou 51 (HCDR2) e SEQ ID NO: 52 (HCDR3) respectivamente, e (ii) uma cadeia leve que compreende a CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que compreende uma sequência da SEQ ID NO: 53, 54 ou 55, respectivamente, em que cada CDR pode opcionalmente compreender 1, 2, 3 ou 4 substituições, deleções ou inserções de aminoácido; (f) um anticorpo tendo (i) uma cadeia pesada que compreende a CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que compreende uma sequência das SEQ ID NOS: 58, 59 ou 60 (HCDR1), SEQ ID NOS: 61 ou 62 (HCDR2) e SEQ ID NO: 63 (HCDR3) respectivamente, e (ii) uma cadeia leve que compreende a CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que compreende uma sequência da SEQ ID NO: 64, 65 ou 66, respectivamente, em que cada CDR pode opcionalmente compreender 1, 2, 3 ou 4 substituições, deleções ou inserções de aminoácido; (g) um anticorpo tendo (i) uma cadeia pesada que compreende as CDRs 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que compreende uma sequência da SEQ ID NO: 172, 173 ou 174 (HCDR1), SEQ ID NO: 175 ou 176 (HCDR2) e SEQ ID NO: 177 (HCDR3) respectivamente, e (ii) uma cadeia leve que compreende a CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que compreende uma sequência da SEQ ID NO: 178, 179 ou 180, respectivamente, em que cada CDR pode opcionalmente compreender 1, 2, 3 ou 4 substituições, deleções ou inserções de aminoácido; e (h) um anticorpo tendo (i) uma cadeia pesada que compreende as CDRs 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que compreende uma sequência da SEQ ID NO: 183, 184 ou 185 (HCDR1), SEQ ID NO: 186 ou 187 (HCDR2) e SEQ ID NO: 188 (HCDR3) respectivamente, e (ii) uma cadeia leve que compreende a CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que compreende uma sequência da SEQ ID NO: 189, 190 ou 191, respectivamente, em que cada CDR pode opcionalmente compreender 1, 2, 3 ou 4 substituições, deleções ou inserções de aminoácido.
[0052] Em um aspecto, é fornecido um anticorpo que especificamente liga KIR3DL2, em que o anticorpo tem uma ou mais (incluindo qualquer combinação dos mesmos, até o grau que tal combinação não seja contraditória) das seguintes propriedades: (a) tem um Kd de menos do que 10-8 M, preferivelmente menos do que 109 M, ou preferivelmente menos do que 10-10 M para a ligação a um polipeptídeo KIR3DL2; (b) liga-se a pelo menos um resíduo no segmento que corresponde aos resíduos de 1 a 98 ou resíduos de 193 a 292 do polipeptídeo KIR3DL2; (c) compete quanto à ligação a um polipeptídeo KIR3DL2 com anticorpo 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 e/ou 20E9; (d) compete ou não com um ligando natural de KIR3DL2 (por exemplo, polipeptídeos HLA HLA-A3, HLA-11 e/ou HLA-B27) quanto à ligação a um polipeptídeo KIR3DL2 (por exemplo, em um ensaio de interação de polipeptídeo); (e) não causa a internalização de polipeptídeos KIR3DL2 em células que expressam KIR3DL2 e/ou não é internalizado dentro das células que expressam KIR3DL2; (f) inibe ou não a sinalização KIR3DL2 induzido por um ligando natural de KIR3DL2 (por exemplo, polipeptídeos HLA HLA-A3, HLA-11 e/ou HLA- B27); (g) não se liga substancialmente a um polipeptídeo KIR3DL1, KIR3DS1, KIR3DL3, KIR2DS1, KIR2DS2, KIR2DL3, KIR2DL1 e/ou KIR2DS4; (h) liga-se a 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 dos polipeptídeos KIR3DL2 (por exemplo, alelos *001, *002, *003, *005, *007 e/ou *008) das SEQ ID NOS: 160, 1, 161, 163, 165 e/ou 166); (i) liga-se a um epítopo que compreende qualquer um ou mais dos resíduos de aminoácido R13, P14, S15, H23, A25, Q27, H32, G33, 160, G62, R78, L82, W226, I231 e/ou R246 de um polipeptídeo KIR3DL2; e (j) tem ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma mutação em um ou mais dos resíduos R13, P14, S15, H23, A25, Q27, H32, G33, 160, G62, R78, L82, W226, I231 e/ou R246 de um polipeptídeo KIR3DL2.
[0053] Em qualquer uma das formas de realização aqui, um anticorpo pode ser caracterizado por qualquer um ou mais traços de (a) a (j), acima.
[0054] Em uma forma de realização, o anticorpo é adequado para o ser humano. Em uma forma de realização o anticorpo é quimérico, por exemplo, contém uma região constante que não de murino, opcionalmente uma de ser humano. Em uma forma de realização, o anticorpo é humano ou humanizado. Em uma outra forma de realização, o anticorpo é um anticorpo de camundongo.
[0055] Em um aspecto de qualquer uma das formas de realização aqui, o isótipo do anticorpo é IgG, opcionalmente IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em uma forma de realização o anticorpo compreende um domínio Fc ou é de um isótipo que é ligado por FcyR (por exemplo, FcyRIIIA), por exemplo, um anticorpo de isótipo IgG1 ou IgG3.
[0056] Em um aspecto de qualquer uma das formas de realização aqui, o anticorpo é um fragmento de anticorpo selecionado de Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, Fv, diacorpos, fragmento de anticorpo de cadeia única, ou um anticorpo multiespecífico que compreende fragmentos de anticorpo diferentes múltiplos. Em um aspecto de qualquer uma das formas de realização aqui, o anticorpo não compreende um domínio Fc ou é de um isótipo que não é substancialmente ligado por FcyR. Em uma forma de realização, o anticorpo é de um isótipo IgG4 ou IgG2.
[0057] Opcionalmente tais anticorpos são além disso tetraméricos (duas cadeias pesadas e duas leves) e são assim bivalentes (por exemplo, anticorpos IgG).
[0058] Em certas formas de realização, os anticorpos compreendem ainda um agente tóxico. Em uma forma de realização, os anticorpos que compreende um agente tóxico são capazes de causar diretamente a morte de células que expressam KIR3DL2. Em uma forma de realização, os anticorpos são capazes de induzir diretamente (por exemplo, na ausência de células efetoras imunes) pelo menos 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % de morte de célula, por exemplo, em um ensaio in vitro, de células que expressam KIR3DL2.
[0059] Em uma forma de realização, os anticorpos são capazes de induzir CDC e/ou ADCC de células que expressam KIR3DL2. Em uma forma de realização, os anticorpos são capazes de induzir pelo menos 20 %, 30, 40 ou 50 % de lise de célula, em um ensaio citotóxico, de células que expressam KIR3DL2 (por exemplo, de Células de linfoma de célula T, células de pacientes SS ou linhagens de célula SS).
[0060] Em uma forma de realização, é fornecido um método de testar um anticorpo anti-KIR3DL2, o dito método compreendendo levar um anticorpo que liga um polipeptídeo KIR3DL2 em contato com uma célula que expressa um polipeptídeo KIR3DL2 e avaliar se o anticorpo é internalizado dentro das células que expressam KIR3DL2 e/ou se o anticorpo induz e/ou aumenta a internalização intracelular de um polipeptídeo KIR3DL2, e selecionar um anticorpo se o anticorpo não induz e/ou não aumenta a internalização intracelular de um polipeptídeo KIR3DL2.
[0061] Em uma outra forma de realização, é fornecido um método de produzir um anticorpo que liga um polipeptídeo KIR3DL2 em um indivíduo mamífero, opcionalmente para o tratamento de um câncer, um distúrbio inflamatório ou um distúrbio autoimune, o dito método compreendendo as etapas de: a) fornecer uma pluralidade de anticorpos, opcionalmente imunizando um mamífero não humano com um imunógeno que compreende um polipeptídeo KIR3DL2 humano; b) determinar se cada uma da pluralidade de anticorpos é capaz de ligação a 1, 2, 3, 4, 5, ou mais alelos de polipeptídeos KIR3DL2 diferente (por exemplo, alelos *001, *002, *003, *005, *007, *008, *009 e/ou *011), opcionalmente em cada caso em que o polipeptídeo KIR3DL2 é expressado na superfície de uma célula, e c) selecionar (por exemplo, para a produção, desenvolvimento, uso em terapia, etc.) um anticorpo da dita pluralidade que seja capaz de ligação a 1, 2, 3, 4, 5, ou mais alelos de polipeptídeos KIR3DL2 diferentes (por exemplo, alelos *001, *002, *003, *005, *007, *008, *009 e/ou *011), opcionalmente em cada caso em que o polipeptídeo KIR3DL2 é expressado na superfície de uma célula. Opcionalmente, o método compreende ainda determinar se cada uma da pluralidade de anticorpos é capaz de ligação a um polipeptídeo KIR3DL1, e selecionar um anticorpo da dita pluralidade que seja capaz de ligação ao dito polipeptídeo KIR3DL1.
[0062] Em uma outra forma de realização, é fornecido um método de produzir um anticorpo que liga um polipeptídeo KIR3DL2 em um indivíduo mamífero, opcionalmente para o tratamento de um câncer, um distúrbio inflamatório ou um distúrbio autoimune, o dito método compreendendo as etapas de: a) fornecer uma pluralidade de anticorpos, opcionalmente imunizando um mamífero não humano com um imunógeno que compreende um polipeptídeo KIR3DL2 humano; e b) selecionar (por exemplo, para produção, desenvolvimento, uso em terapia, etc.) um anticorpo da dita pluralidade que:
[0063] se liga ao polipeptídeo KIR3DL2 mas não a um polipeptídeo KIR3DL1; e/ou (a) (ii) (a) se liga a pelo menos um resíduo no segmento que corresponde aos resíduos de 99 a 192, do polipeptídeo KIR3DL2 maduro da SEQ ID NO: 1, e/ou a qualquer um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou mais) dos resíduos R13, P14, S15, H23, A25, Q27, H32, G33, 160, G62, R78, L82, W226, I231 e/ou R246, e/ou tem ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma substituição de aminoácido no(s) dito(s) resíduo(s),
[0064] ou (b) se liga a pelo menos um resíduo no segmento que corresponde aos resíduos 198, do polipeptídeo KIR3DL2 maduro da SEQ ID NO: 1, e/ou a qualquer um ou mais (por exemplo, 2, 3, 4, 5 ou mais) dos resíduos R13, P14, S15, H23, A25, Q27, H32, G33, 160, G62, R78, L82, W226, I231 e/ou R246, e/ou tem ligação reduzida a um polipeptídeo KIR3DL2 tendo uma substituição de aminoácido no(s) dito(s) resíduo(s); e/ou
[0065] (iii) não é internalizado dentro das células que expressam KIR3DL2 e/ou não induzem e/ou aumentam a internalização intracelular de um polipeptídeo KIR3DL2.
[0066] Em um aspecto, são fornecidos métodos de inibir a atividade biológica de uma célula que expressa KIR3DL2 que compreende levar a célula em contato com anticorpos anti-KIR3DL2, in vitro, ex vivo ou in vivo. Opcionalmente o dito levar em contato é na presença de um ligando (por exemplo, HLA) de KIR3DL2, opcionalmente uma célula que expressa um ligando (por exemplo, HLA) de KIR3DL2. Preferivelmente a célula que expressa KIR3DL2 é uma célula imune, por exemplo, uma célula T ou uma célula NK, uma célula T maligna ou célula NK, uma célula CD4 Th17 (por exemplo, uma das células T CD4 pró-inflamatórias que expressam IL-23R e produzem IL-17A) ou uma célula pró-inflamatórias NK que expressa produz IL-17A. Em uma forma de realização, são fornecidos métodos de inibir a atividade biológica de uma célula T ou NK que expressa KIR3DL2 que produz IL-17A que compreende levar a célula em contato com anticorpos anti-KIR3DL2, in vitro, ex vivo ou in vivo. Preferivelmente a atividade biológica é ativação, atividade lítica, produção de citocina (por exemplo, IL-17A) e/ou proliferação celular. Preferivelmente a atividade biológica é induzida pela sinalização de ligando (por exemplo, induzido por HLA). Em um aspecto, são fornecidos métodos de inibir a atividade biológica de uma célula que expressa KIR3DL2 que compreende levar a célula em contato com um anticorpo anti- KIR3DL2, in vitro, ex vivo ou in vivo.
[0067] Em um aspecto, são fornecidos métodos de eliminar ou esgotar uma célula que expressa KIR3DL2 que compreende levar a célula em contato com um anticorpo anti-KIR3DL2, in vitro, ex vivo ou in vivo. A célula pode ser, por exemplo, uma célula T maligna ou célula NK, uma célula T ou uma célula NK, uma célula Th17 CD4 (por exemplo, uma células T CD4 pró-inflamatória que expressa IL-23R e produz IL-17A) ou uma célula NK pró-inflamatória que expressa produz IL-17A.
[0068] Em um aspecto, são fornecidos métodos de tratamento usando os anticorpos anti-KIR3DL2 aqui. Os anticorpos podem ser usados como tratamento profilático ou terapêutico; em qualquer uma das formas de realização aqui, uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo pode ser intercambiado com uma quantidade profilaticamente eficaz de um anticorpo. Em um aspecto, é fornecido um método de tratar um paciente com um câncer, por exemplo, um linfoma de célula T, um CTCL CD4+ ou CD8+, síndrome de Sezary (SS), micose fungóide (MF), um linfoma de célula T CD30+, o método compreendendo administrar ao paciente uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um composto de ligação de antígeno aqui descrito que especificamente se liga a um polipeptídeo KIR3DL2. Em uma outra forma de realização, é fornecido um método de tratar um paciente com um distúrbio autoimune ou inflamatório mediado pelo menos em parte pelas células T que expressam KIR3DL2, o método compreendendo administrar ao paciente uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um composto de ligação de antígeno aqui descrito que especificamente se liga a um polipeptídeo KIR3DL2.
[0069] Os métodos de tratamento e o anticorpo anti-KIR3DL2 podem ser usados para tratar um indivíduo em combinação com um segundo agente terapêutico, incluindo imunomoduladores (por exemplo, medicamentos quimioterapêuticos, medicamentos anti-inflamatórios, vacinas contra tumor, anticorpos que se ligam a antígenos específicos de tumor nas células de tumor, anticorpos que induzem ADCC contra células de tumor, anticorpos que potenciam respostas imunes, medicamentos anti-reumáticos modificador de doença (DMARDs), etc.). Em uma forma de realização, o segundo agente terapêutico é um anticorpo anti-CD4 ou um anticorpo anti-CD30.
[0070] A presente divulgação diz respeito ainda a um método para selecionar indivíduos tendo uma doença que responda a um tratamento usando um antagonista de KIR3DL2 (por exemplo, um anticorpo que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2), o método compreendendo determinar se as células relacionadas com a doença no dito indivíduo expressam um receptor de KIR3DL2, a expressão de um receptor de KIR3DL2 sendo indicativa de um indivíduo respondedor. Opcionalmente, o método compreende ainda administrar a um indivíduo respondedor um anticorpo (por exemplo, um anticorpo anti- KIR3DL2 da invenção) que se liga a um polipeptídeo KIR3DL2. Em uma forma de realização, o método é usado para selecionar indivíduos tendo um câncer, e as células relacionadas com doença são células cancerosas. Em uma forma de realização, o método é usado para selecionar indivíduos tendo um distúrbio inflamatório ou autoimune, e as células relacionadas com doença são células T.
[0071] A expressão de um receptor de KIR3DL2 na dita célula relacionada com doença pode ser determinada usando um Ligando específico de KIR3DL2. Preferivelmente, o ligando é um anticorpo, ou um fragmento ou derivado dos mesmos Em um aspecto, a presente invenção fornece composições que compreendem, e métodos de usar anticorpos monoclonais, incluindo mas não limitado aos fragmentos de anticorpo, e derivados que especificamente ligam KIR3DL2 humano.
[0072] Em um outro aspecto, é fornecido um método (por exemplo, um método de conduzir um ensaio de diagnóstico, um ensaio respondedor, etc.), que compreende avaliar se um paciente tem células relacionadas com doença que expressam um polipeptídeo KIR3DL2, por exemplo, um polipeptídeo KIR3DL2 (um ou mais alelos de KIR3DL2) ligadas por um anticorpo aqui descritas. O dito método pode compreender, por exemplo, obter uma amostra biológica de um paciente que compreende células relacionadas com doença, levar as ditas células relacionadas com doença em contato com tal anticorpo e avaliar se o anticorpo se liga às células relacionadas com doença. Uma descoberta de que KIR3DL2 é expressado pelas células relacionadas com doença indica que o paciente tem uma condição caracterizada pelas células que expressam KIR3DL2 e/ou é adequado para tratamento com um anticorpo anti-KIR3DL2 aqui descrito. O paciente pode ser tratado ainda com um tratamento adequado para a doença particular caracterizada pelas células que expressam KIR3DL2. Opcionalmente o paciente é tratado com o anticorpo anti-KIR3DL2. Em uma forma de realização, o método é usados para selecionar indivíduos tendo um câncer, e a células relacionadas com doença são células cancerosas. Em uma forma de realização, o método é usado para selecionar indivíduos tendo um distúrbio inflamatório ou autoimune, e a células relacionadas com doença são células T. Em uma forma de realização, o anticorpo levado em contato com células relacionadas com doença de modo a avaliar se o anticorpo se liga às células relacionadas com doença é um anticorpo aqui descrito.
[0073] Também é fornecido um método de tratar um paciente, o método compreendendo: a) determinar se o paciente tem células patogênicas que expressam KIR3DL2, e b) se o paciente é determinado ter células patogênicas que expressam KIR3DL2, administrar um composto de ligação de antígeno (por exemplo, anticorpo) da divulgação. (b) Também é fornecido um método para a avaliação do nível de desenvolvimento de um CTCL (estadiamento de doença) permitindo a avaliação da proporção (por exemplo, porcentagem) de células CD4+ CTCL malignas presentes dentro de um certo compartimento corporal de um paciente. De acordo com este método, as células de uma amostra biológica coletada do dito compartimento corporal são levadas em contato com um anticorpo anti-KIR3DL2 da divulgação e a proporção de células CD4+ que expressam um polipeptídeo KIR3DL2 na sua superfície é medida. A proporção de células CD4+ CTCL que estão de fato presentes no dito compartimento corporal pode ser considerada como substancialmente igual à dita proporção medida, por exemplo, dentro de uma faixa de ± 10 % em torno desta proporção medida.
[0074] Também é fornecido um método para o diagnóstico de CTCL, que compreende levar células de uma amostra biológica de um indivíduo em contato com um anticorpo anti-KIR3DL2 da divulgação e a proporção (por exemplo, porcentagem) de células T que expressam um polipeptídeo KIR3DL2 na sua superfície é medida, e comparando tal proporção com a proporção média (por exemplo, porcentagem) de células T que expressam um polipeptídeo KIR3DL2 na sua superfície observada em seres humanos não CTCL (preferivelmente em seres humanos saudáveis), em que um diagnóstico positivo em CTCL é feito quando a dita proporção medida é significantemente mais alta do que a dita proporção média.
[0075] Estes e aspectos e traços vantajosos adicionais da invenção podem ser aqui descritos ainda em outro lugar.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DOS DESENHOS
[0076] A Figura 1 mostra uma vista do polipeptídeo KIR3DL2, incluindo porções dentro do domínio D0, mostrando resíduos de aminoácido mutados indicados como “Mutante 1”, “Mutante 2”, “Mutante 3” e “Mutante 6” que resultaram (em combinações diferentes) na perda de ligação pelos anticorpos.
[0077] A Figura 2 mostra uma vista do polipeptídeo KIR3DL2, incluindo porções dentro do domínio D0, mostrando resíduos de aminoácido mutados indicados como “Mutante 1”, “Mutante 2” e “Mutante 3”, mutantes 1, 2 e 6 resultando (em combinações diferentes) na perda de ligação pelos anticorpos 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5 e 13H1, com sombreamento dos resíduos adjacentes aos resíduos (F9, S11, P14, F34 e/ou S140 adjacentes ao mutante 2, e G21, G22, H23, E57, S58, F59, P63 e/ou H68 adjacentes ao mutante 1).
[0078] A Figura 3 mostra uma vista de cada face do polipeptídeo KIR3DL2, incluindo porções dentro do domínio D0, mostrando resíduos de aminoácido mutados indicados como “Mutante 6” que resultaram na perda de ligação pelo anticorpo 5H1, com “Mutante 3” que não resultou na perda da ligação mostrada. Também mostrado no sombreamento são resíduos adjacentes aos resíduos adjacentes ao mutante 6 que também podem ser ligados pelo anticorpos (K7, Y30, R31, P79, H80, S81, T83, G84, W85, S86 e/ou A87).
[0079] A Figura 4 mostra uma vista do polipeptídeo KIR3DL2, incluindo porções dentro do domínio D2 (junção D1/D2), mostrando resíduos de aminoácido mutados indicados como “Mutante 14” aos quais os anticorpos 1C3 e 20E9 perdem a ligação, e “Mutante 12” e “Mutante 17” que não causaram a perda de ligação pelos anticorpos; também mostrado no sombreamento estão os resíduos adjacentes aos resíduos (Q201, K202, P203, S204, S224, S225, S227, S228, N252, R253 e/ou T254 adjacentes ao mutante 14).
[0080] A Figura 5 mostra uma vista do polipeptídeo KIR3DL2, incluindo porções dentro do domínio D2 (junção D1/D2), mostrando os resíduos de aminoácido mutados indicados como “Mutante 15” aos quais o anticorpo 20E9 perde a ligação; também mostrados no sombreado são resíduos adjacentes aos resíduos (D230, I231, R244, L245, R246, A247, V248, S275, R277 e/ou P280) adjacentes ao mutante 14).
[0081] A Figura 6 mostra a capacidade dos anticorpos para mediar CDC; mAbs anti-KIR3DL2 que ligam o domínio D0 estão em cinza, aqueles que ligam o domínio D1 estão em preto, mostrando que com os mAbs de murino precursores, o isótipo do mAb tem a influência mais proeminente em CDC.
[0082] A Figura 7 mostra que a internalização de KIR3DL2 na ligação totalmente anula a capacidade de mo19H12 para matar B221-KIR3DL2 com recrutamento de complemento, ao passo que em condições de temperatura que limitam a internalização, a atividade de CDC de mo19H12 é claramente observada.
[0083] A Figura 8 mostra a capacidade de mAbs anti-KIR3DL2 quimérico para mediar CDC contra B221-KIR3DL2 in vitro.
[0084] A Figura 9 mostra a capacidade de uma série de mAbs anti-KIR3DL2, testado na mesma concentração final (10 μg/ml), para matar a linhagem de célula de Sezary prototípica HUT78 através de um mecanismo mediado pela ADCC.
[0085] A Figura 10 mostra a capacidade de mAbs anti-KIR3DL2 para a morte mediada por ADCC de células B221 transfectadas com KIR3DL2. Os mAbs mostrados em cinza induzem a internalização do receptor e parecem ser menos eficiente do que os 4 outros mAbs que não induzem a internalização de KIR3DL2.
[0086] A Figura 11 mostra uma comparação de anticorpos em um experimento de variação de dose a capacidade de mAbs anti-KIR3DL2 huIgG1 quimerizados para mediar ADCC contra alvos B221 que expressam KIR3DL2.
[0087] A Figura 12 mostra o resultado de um experimento (n = 6 camundongos NOD-SCID por grupo) em que a eficácia de 3 isótipos anti- KIR3DL2 de IgG2b de murino 9E10 e 19H12 foi testada contra xenoenxertos SC B221-KIR3DL2. O anticorpo anti-D0 não internalizantes 9E10 mostraram sobrevivência aumentada comparada tanto ao PBS quanto anticorpo anti-D1 internalizante 19H12.
[0088] A Figura 13 mostra o resultado de um outro experimento (n = 6 camundongos NOD-SCID por grupo) em que a eficácia de anti-KIR3DL2 de murino 19H12 foi testada contra xenoenxertos SC RAJI-KIR3DL2. In vitro, as células RAJI transfectadas com KIR3DL2 mostraram menos internalização na ligação de mAb do que B221-KIR3DL2 ou linhagens de célula de Sezary. No modelo de xenoenxerto RAJI-KIR3DL2, o mAb mo19H12 foi mais eficiente do que no modelo B221-KIR3DL2. Isto é devido à internalização menos potente do alvo in vivo.
[0089] A Figura 14 mostra que os anticorpos KIR3DL2 de domínios D0 inibem a ligação de dímeros de cadeia pesada (B272) HLA-A3 e B27. Tingimento FACS representativo mostrando o efeito de anticorpos D0 anti-KIR3DL2 sobre a ligação de tetrâmeros HLA-A3 e B272 às células Baf3 transduzidas com KIR3DL2. (Representativo de 1 de três experimentos independentes).
[0090] A Figura 15 mostra que os anticorpos de domínios anti-D1 e anti-D2 de KIR3DL2 (anticorpo1C3) inibem HLA-A3 mas não a ligação de dímeros de cadeia pesada B27 (B272). O tingimento de FACS representativo mostrando o efeito de anticorpos anti KIR3DL2 D1/D2 sobre a ligação de tetrâmero HLA-A3 e B272 às células Baf3 transduzidas em KIR3DL2. (Representativo de 1 de três experimentos independentes).
[0091] A Figura 16A mostra que os anticorpos dos domínios D0 de KIR3DL2 inibem a ligação de dímero tetrâmero de cadeia pesada HLA-A3 e B27. A Figura 16B. O mAb de domínio Anti-D2 (1C3) inibe a ligação do tetrâmero HLA-A3 mas não a do dímero de cadeia pesada B27 (B272). Os resultados são expressados como % da cepa de tetrâmero na presença de Mab de controle de isótipo.
[0092] A Figura 17 mostra que os anticorpos dos domínios D0 de KIR3DL2 mas não os anticorpos dos domínios D1/D2 inibem a secreção de IL-2 pela célula repórter CD3e de KIR3DL2 estimulada com linhagens de célula B que expressam HLA-B27 (221B27). Os anticorpos D0s inibem a produção de IL-2 pelas células repórter estimuladas com linhagens de célula B que expressam HLA classe 1 de controle a um grau menor comparado com células estimuladas com HLA-B27. Os ELISAs representativos para produção de IL-2 de um de três experimentos independentes.
[0093] A Figura 18 mostra uma vista do polipeptídeo KIR3DL2 alelo *001, incluindo o sítio de ligação de anticorpo que corresponde ao mutante 2 tendo substituições I60N e G62S dentro do domínio D0 (por exemplo, sítio de ligação para anticorpos 2B12, 10F6, 18C10, 10G5 e 13H1). Também são mostrados na figura as diferenças de aminoácido entre alelo *001 e alelos *002, *004, *006/*007, *008 e *009 de KIR3DL2.
[0094] A Figura 19 mostra uma vista alternativa do polipeptídeo KIR3DL2 alelo *001, incluindo o sítio de ligação de anticorpo que corresponde ao mutante 2 tendo substituições I60N e G62S dentro do domínio D0. Também são mostrados na figura as diferenças de aminoácido entre KIR3DL2 alelo *001 e alelos *005 e *003/*011.
[0095] A Figura 20 mostra duas vistas alternativas (frente e verso) do polipeptídeo KIR3DL2 alelo *001, incluindo o sítio de ligação de anticorpo que corresponde ao mutante 2 tendo substituições I60N e G62S dentro do domínio D0. Também são mostradas na figura diferenças de aminoácido entre KIR3DL2 alelo *001 e alelo *004.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO INTRODUÇÃO
[0096] Os anticorpos da divulgação são capazes de direta e especificamente alvejar células que expressam KIR3DL2, notavelmente células T CD4+, KIR3DL2+, sem alvejar outras células tais como células KIR3DL1+ (ou células KIR3DL2+ KIR3DL1+, células KIR3DS1+; ou células KIR3DS1 KIR3DL2+), e não internalizar dentro de células KIR3DL2+. Também são fornecidos anticorpos que inibem ou não a ligação de ligandos naturais de KIR3DL2 (ou sinalização de KIR3DL2 induzida por ligando). A divulgação fornece vários anticorpos tendo tais propriedades, e que competem entre si quanto à ligação a uma região de KIR3DL2+ que inclui os domínios 0 e 2 definidos pelos resíduos de aminoácido de 1 a 98 e resíduos de 193 a 292, respectivamente, dos polipeptídeos maduros KIR3DL2 da SEQ ID NO: 1.
[0097] KIR3DL2 (CD158k) é um homodímero ligado a dissulfeto de três moléculas de domínio de Ig de cerca de 140 kD, descrito em Pende et al. (1996) J. Exp. Med. 184: 505-518, a divulgação da qual é incorporada aqui por referência. KIR3DL1 (CD158e1) é uma molécula monomérica de cerca de 70 kD, descritos em Colonna e Samaridis (1995) Science 268 (5209), 405-408; a bolsa de ligação de HLA foi descrita em Vivian et al. (2011) Nature 479: 401-405. Os ligandos naturais de KIR3DL2 incluem, inter alia, polipeptídeos HLA-A e HLA-B, notavelmente HLA-A3 e HLA-A11 (ver Hansasuta et al. (2004) Eur. J. Immunol. 34: 1673-1679 e HLA-B27. HLA-B27 (ver, por exemplo, Weiss et al. (1985) Immunobiology 170(5): 367-380 para organização, sequência e expressão do gene HLA-B27, e para multímeros HLA-B27 e homodímeros HLA-B272 ver Allen et al. (1999) J. Immunol. 162: 5045-5048 e Kollnberger et al (2007) Eur. J. Immunol. 37: 1313-1322. As divulgações de todas as referências acima são aqui incorporadas por referência. Como aqui usado, “KIR3D” refere-se a qualquer receptor de KIR3D (por exemplo, KIR3DL1, KIR3DL2, KIR3DS1) individual ou coletivamente, e o termo “KIR3D” pode ser substituído pelo termo “KIR3DL1, KIR3DL2 e/ou KIR3DS1”. Similarmente, “KIR3DL” refere-se a qualquer receptor de KIR3DL (por exemplo, KIR3DL1, KIR3DL2) individual ou coletivamente, e o termo “KIR3DL” pode ser substituído pelo termo “KIR3DL1 e/ou KIR3DL2”. Os termos “KIR3D”, “KIR3DL”, “KIR3DL1”, “KIR3DL2”, “KIR3DS1” cada um além disso inclui qualquer variante, derivado, ou isoforma do gene KIR3D ou proteína(s) codificada(s) ao(s) qual(is) se referem. Várias variantes alélicas foram relatadas para os polipeptídeos KIR3D (por exemplo, KIR3DL2), cada um destes são abrangidos pelos respectivos termos. A sequência de aminoácido do KIR3DL2 humano maturo (alelo *002) é mostrada na SEQ ID NO: 1, que corresponde ao acesso no Genbank no. AAB52520 em que a sequência líder de 21 resíduos de aminoácido foi omitida, e que corresponde à base de dados IPD KIR (publicado pelo EMBL-EBI, European Bioinformatics Institute, Reino Unido) acesso no. KIR00066. O cDNA de KIR3DL2 (alelo *002) é mostrado no acesso do Genbank no. U30272. A sequência de aminoácido precursora (incluindo sequência líder) de um alelo *002 de KIR3DL2 humano é mostrada na SEQ ID NO: 159, que corresponde ao acesso do Genbank no. AAB52520. A sequência de aminoácido de um alelo *001 de KIR3DL2 humano é mostrada na SEQ ID NO: 160, que corresponde ao acesso da base de dados IPD KIR no. KIR00065. A sequência de aminoácido de um alelo *003 de KIR3DL2 humano é mostrado na SEQ ID NO: 161, que corresponde ao aceso do Genbank no. AAB36593 e acesso da base de dados IPD KIR no. KIR00067. A sequência de aminoácido de um alelo *004 de KIR3DL2 humano é mostrada na SEQ ID NO: 162, que corresponde ao acesso da base de dados IPD KIR no. KIR00068. A sequência de aminoácido de um alelo *005 de KIR3DL2 humano é mostrado na SEQ ID NO: 163, que corresponde ao acesso da base de dados acesso da base de dados IPD KIR no. KIR00069. A sequência de aminoácido de um alelo *006 de KIR3DL2 humano (maduro) é mostrada na SEQ ID NO: 164, que corresponde ao acesso do Genbank no. AAK30053 e acesso da base de dados IPD KIR no. KIR00070. A sequência de aminoácido de um alelo *007 de KIR3DL2 humano (maduro) é mostrada na SEQ ID NO: 165, que corresponde ao acesso do Genbank no. AAK30052 e acesso da base de dados IPD KIR no. KIR00071. A sequência de aminoácido de um alelo *008 de KIR3DL2 humano é mostrada na SEQ ID NO: 166, que corresponde ao acesso do Genbank no. AAK30054 e acesso da base de dados IPD KIR no. KIR00072. A sequência de aminoácido de um alelo *009 de KIR3DL2 humano é mostrada na SEQ ID NO: 167, que corresponde ao acesso da base de dados IPD KIR no. KIR00457. A sequência de aminoácido de um alelo *011 KIR3DL2 humano é mostrada na SEQ ID NO: 168, que corresponde ao acesso da base de dados IPD KIR no. KIR00544. O cDNA que codifica um polipeptídeo KIR3DL1 (CD158e2) (alelo *00101) é mostrado no acesso do Genbank no. L41269; a sequência de aminoácido codificada é mostrada na SEQ ID NO: 169, que corresponde ao acesso do Genbank no. AAA69870. Onde uma sequência líder está presente em uma SEQ ID NO particular descrevendo uma sequência de polipeptídeo KIR3DL2 (por exemplo, SEQ ID NOS: 1 e 159 a 168), qualquer referência às posições de resíduo de aminoácido aqui será para o polipeptídeo KIR3DL maduro.
[0098] São fornecidos métodos de usar os compostos de ligação de antígeno; por exemplo, um método para inibir a proliferação ou atividade celulares, para liberar uma molécula em uma célula (por exemplo, uma molécula tóxica, um marcador detectável, etc.), para alvejar, identificar ou purificar uma célula, para esgotar, matar ou eliminar uma célula, para reduzir a proliferação celular, o método compreendendo expor uma célula, tal como uma célula T que expressa um polipeptídeo KIR3DL, a um composto de ligação de antígeno da divulgação que liga um polipeptídeo KIR3DL2. Será avaliado que para os propósitos da presente divulgação, “proliferação celular” pode referir-se a qualquer aspecto do crescimento ou proliferação de células, por exemplo, crescimento celular, divisão celular, ou qualquer aspecto do ciclo celular. A célula pode estar em cultura de célula (in vitro) ou em um mamífero (in vivo), por exemplo, um mamífero sofrendo de uma patologia que expressa KIR3DL2. Também é fornecido um método para induzir a morte de uma célula ou inibir a proliferação ou atividade de uma célula que expressa um polipeptídeo KIR3DL2, que compreende expor a célula a um composto de ligação de antígeno que liga um polipeptídeo KIR3DL2 ligado a um agente tóxico, em uma quantidade eficaz para induzir a morte e/ou inibir a proliferação da célula. Assim, é fornecido um método para tratar um mamífero que sofre de uma doença proliferativa, e qualquer condição caracterizada por uma expansão ou ativação patogênicas de células que expressam um polipeptídeo KIR3DL2, o método compreendendo administrar uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um composto de ligação de antígeno aqui divulgado ao mamífero. Os exemplos de tais condições incluem Síndrome de Sezary, Micose Fungóide, CTCL, e condições autoimunes ou inflamatórias, por exemplo, artrite, doença cardiovascular. Preferivelmente tais células patogenicamente expandidas expressam KIR3DL2 mas não expressam proeminentemente KIR3DL1 (por exemplo, não mais do que 20 %, 40 %, 50 % ou 60 % das células patogênicas expressam KIR3DL1, estas condições beneficiando-se particularmente dos anticorpos seletivos.
[0099] Vários distúrbios que expressam KIR3DL2, particularmente distúrbios mediados pelas células T e NK podem ser tratados ou diagnosticados usando os métodos e composições da divulgação. Os distúrbios podem ser por exemplo malignidades de célula T CD4+ tais como CTCL, MF ou SS, ou distúrbios autoimunes ou inflamatórios onde a eliminação ou inibição da atividade e/ou proliferação de células T e/ou NK seriam úteis. As células T CD4+ incluem por exemplo células T CD4+ ativadas, células T Th17, células T CD4+ que expressam ou não um ou mais outros marcadores (por exemplo, CD2+, CD3+, CD5+, CD8-, CD28±, CD28-, CD45RO+ e TCR+). As células T CD4+CD28-, por exemplo, são conhecidas por serem capazes de expressar KIR3DL2 e estão presentes em altas frequências de células clonalmente expandidas em alguns distúrbios autoimunes e inflamatórios mas são raros em indivíduos saudáveis. Estas células T podem ser citotóxicas, secretar grandes quantidades de IFN- gama, e proliferar na estimulação com células mononucleares aderentes autólogas.
[00100] Os anticorpos da divulgação têm a vantagem de ligação através de alelos de KIR3DL2 diferentes permitindo um amplo uso para tratar, caracterizar e diagnosticar doenças. As células MF/SS cutâneas e circulantes foram relatadas não expressar alelos preferenciais entre nove alelos KIR3DL2 testados. Treze alelos também foram descritos até agora. Considerando que o receptor p140 de KIR3DL2 é expressado em um subconjunto menor de células NK e em células T CD8+ raras em pessoas saudáveis, o mesmo parece ser restrito às células T CD4+ de tumor CTCL em pacientes MF/SS. Outros receptores que são usualmente observados na superfície das células NK (tais como p58,1, p58,2, p7OKIRs, CD94/NKG2A) não são encontradas na superfície de células T CD4+ malignas (Bahler D. W. et al., (2008) Cytometry B Clin Cytom. 74(3): 156-62). As células SS também são tipicamente caracterizadas, além das CD4+, tendo-se um fenótipo de linfócito T maduro, CD2+, CD3+, CDS+, CD8-, CD28+, CD45R0+ e TCRocr3+.
[00101] Os métodos e composições da divulgação podem ser usados no tratamento de condições autoimunes e inflamatórias caracterizadas pela expressão de KIR3DL2, eliminando-se as células que expressam KIR3DL2 e/ou inibindo-se a atividade biológica das células que expressam KIR3DL2 (isto é bloqueando-se a sinalização de KIR3DL2 induzida pelos seus ligandos naturais). Inibir a atividade biológica das células que expressam KIR3DL2 pode compreender por exemplo diminuir a proliferação de células que expressam KIR3DL2, diminuir a reatividade ou citotoxicidade de células que expressam KIR3DL2 para as células alvo, diminuir a ativação, marcadores de ativação (por exemplo, expressão de CD107) e/ou produção de citocina (por exemplo, produção de IFN) por uma célula que expressa KIR3DL2, e/ou diminuir a frequência in vivo de tais células ativadas, reativas, citotóxicas e/ou ativadas que expressam KIR3DL2.
[00102] Por exemplo, foi mostrado que vários de tais distúrbios são mediados pelo menos em parte pelas células T CD4+, incluindo células T CD4+CD28nula particulares. A ativação de células T CD4+ é geralmente considerada ser controlada pela interação entre receptores estimuladores e inibidores, onde uma predominância de sinais estimuladores favorece as reações autoimunes. Chan et al. ((2005) Arthrit. Rheumatism 52(11): 3586-3595 relatam que o número aumentado de células T CD4+ e células NK do sangue periférico e fluido sinovial expressam KIR3DL2 na espondiloartrite. Em pacientes com artrite reumatóide, a expressão da molécula coestimuladora crítica, CD28, é frequentemente perdida. Ao invés, uma população de célula T CD4+ que carece de CD28 (células T CD4+CD28-) expressam receptores matadores semelhantes à imunoglobulina (KIRs). As células T CD4+CD28nula em particular foram relatadas expressar polipeptídeos KIR3D. Comparada com as suas contrapartes CD28+, as células CD4+CD28- produzem níveis significantemente mais altos de IFN- dando a elas a capacidade para funcionar como células pró-inflamatórias. Os clones de célula T CD4+CD28nula persistem por anos em circulação. Estas células T são conhecidas diferirem das células T CD28+ por serem resistentes à apoptose mediada por Fas na reticulação de CD3. As células T CD28nula progridem através do ciclo celular, e células em todos os estágios do ciclo celular são resistentes à apoptose, diferente das suas contrapartes CD28+. A desregulagem de caminhos apoptóticos em células T CD4+CD28nula foi mostrada favorecer o seu crescimento clonal e manutenção in vivo. Namekawa et al. ((2000) J. Immunol. 165: 11381145 relatam que KIR, incluindo KIR3DL2, foi presente nas células T CD4+CD28nula expandidas na artrite reumatóide. A artrite reumatóide envolve infiltrados linfocíticos, mediadores inflamatórios, e hiperplasia sinovial resultando da proliferação agressiva de sinoviócitos semelhantes a fibroblasto e macrófagos. Os prognósticos de erosões de junta e severidade de doença correlacionam-se com altas frequências de células T CD4+CD28- clonalmente expandidas. Lamprecht et al. (2001) Thorax 56: 751-757 relatam o recrutamento de células T CD4+CD28- na granulomatose de Wegener. Markovic-Plese et al. (2001) J Clin Invest. 108: 1185-1194 relatam a presença de células T independentes da coestimulação de CD4+CD28- no CNS, e sua associação com a esclerose múltipla. Os métodos e composições portanto podem ser usados no tratamento ou prevenção da granulomatose de Wegener, esclerose múltipla ou outros distúrbios inflamatórios ou autoimunes do sistema nervoso central, artrite, ou outros distúrbios reumáticos caracterizados pela inflamação.
[00103] As células T CD4+CD28- também foram associadas com distúrbios cardiovasculares. Betjes et al. (2008) Kidney International 74, 760-767 relatam que o risco aumentado para a doença aterosclerótica em pacientes com soropositividade pelo Citomegalovírus (CMV) está associada com o aumento dependente da idade de células T CD4+CD28-, que podem compreender mais da metade das células T CD4 circulante nos indivíduos. Os pacientes acima dos 50 anos de idade foram relatados ter uma porcentagem 50 vezes mais alta de células T CD4+CD28- comparados com pacientes soronegativos em CMV e uma porcentagem 5 vezes mais alta quando comparados com os controles saudáveis soropositivos. Nakajima et al. ((2003) Circ. Res. 93: 106-113) relatam a expressão de novo de KIR na síndrome coronária aguda, onde as células T CD4+ de pacientes com a síndrome coronária aguda (ACS) expressam KIR múltiplo ao passo que células T CD4+CD28nula normais de doadores saudáveis não expressam KIR. Yen et al. Journal of Experimental Medicine, Volume 193, Número 10, 21 de maio de 2001 1159-1168 estudaram clones de célula T CD4+CD28nula estabelecidas de pacientes com vasculite reumatóide para a expressão de KIR inibidores e estimuladores pela RT-PCR. Em pacientes com artrite reumatóide e um paciente com ACS, os padrões de expressão favoreceram os KIR inibidores, incluindo KIR3DL2, ao passo que a expressão de receptores estimuladores foi altamente restringida ao KIR2DS2. Os métodos e composições portanto podem ser usados no tratamento ou prevenção de distúrbios cardiovasculares, por exemplo, ACS, doença aterosclerótica, vasculite reumatóide, caracterizados pela inflamação.
[00104] Bowness et al (2011) J. Immunol. 186: 2672-2680 relatam que as células T CD4 de KIR3DL2+ são responsáveis pela maioria das expressões de IL-23R pelas células T CD4 de sangue periférico, e que tais células KIR3DL2+ do tipo Th17 produzem mais IL-17 na presença de IL-23. A despeito das células KIR3DL2+ que compreendem uma média de apenas 15 % de T CD4 no sangue periférico de pacientes SpA, este subconjunto responsabilizou-se por 70 % do aumento observado nos números de Th17 em pacientes SpA comparados com os indivíduos de controle. As linhagens de célula T CD4 de KIR3DL2+ do sangue periférico estimulado por TCR de pacientes SpA secretaram 4 vezes mais IL-17 do que as linhagens de KIR3DL2+ dos controles ou células T CD4 de KIR3DL2-.
[00105] São fornecidos métodos para produzir e usar anticorpos e outros compostos adequados para o tratamento de distúrbios (por exemplo, cânceres, distúrbios inflamatórios e autoimunes) onde a eliminação das células que expressam KIR3DL2 seria útil. Os anticorpos, derivados de anticorpo, fragmentos de anticorpo, e célula que os produzem são abrangidos, como o são os métodos de produzir os mesmos e métodos de tratar pacientes usando os anticorpos e compostos.
[00106] Visto que os presentes anticorpos são específicos para KIR3DL2, eles podem ser usados para uma faixa de propósitos, incluindo purificar KIR3DL2 ou células que expressam KIR3DL2, modular receptores (por exemplo, ativadores ou inibidores) de KIR3DL2 in vitro, ex vivo, ou in vivo, alvejar células que expressam KIR3DL2 para a destruição in vivo, ou especificamente rotulação/LIGAÇÃO KIR3DL2 in vivo, ex vivo, ou in vitro, incluindo métodos tais como imunomanchamento, análise IHC, isto é sobre biópsias congeladas, análise de FACS, e imunoprecipitação.
DEFINIÇÕES
[00107] Como usado no relatório descritivo, “um” ou “uma” podem significar um ou mais. Como usado na(s) reivindicação(ões), quando usado em conjunção com a palavra “compreendendo”, a palavras “um” ou “uma” podem significar um ou mais do que um. Como aqui usado “um outro” pode significar pelo menos um segundo ou mais.
[00108] Onde “compreendendo” é usado, este pode ser preferivelmente substituído por “consistindo essencialmente de”, mais preferivelmente por “consistindo de”.
[00109] “Tratamento de uma doença proliferativa” ou “tratamento de um tumor”, ou “tratamento de câncer” ou os seus semelhantes, com referência ao agente de ligação anti-KIR3DL2 (por exemplo, anticorpo), inclui, mas não é limitado a: (a) método de tratamento de uma doença proliferativa, o dito método compreendendo a etapa de administrar (para pelo menos um tratamento) um agente de ligação anti-KIR3DL2, (por exemplo, em um material carregador farmaceuticamente aceitável) a um animal de sangue quente, especialmente um ser humano, em necessidade de tal tratamento, em uma dose que possibilite o tratamento da dita doença (uma quantidade terapeuticamente eficaz), por exemplo, em uma dose (quantidade) como especificado acima e aqui abaixo; (b) o uso de um agente de ligação anti-KIR3DL2 para o tratamento de uma doença proliferativa, ou um agente de ligação anti-KIR3DL2, para o uso no dito tratamento (especialmente em um ser humano); (c) o uso de um agente de ligação anti-KIR3DL2, para a fabricação de uma preparação farmacêutica para o tratamento de uma doença proliferativa, um método de usar um agente de ligação anti-KIR3DL2 para a fabricação de uma preparação farmacêutica para o tratamento de uma doença proliferativa, compreendendo administrar um agente de ligação anti-KIR3DL2 com um carregador farmaceuticamente aceitável, ou de uma preparação farmacêutica compreendendo uma dose eficaz de um agente de ligação anti-KIR3DL2 que é apropriado para o tratamento de uma doença proliferativa; ou (d) qualquer combinação de a), b), e c), de acordo com a matéria objeto permitida para o registro de patente em um país onde este pedido é depositado. Em casos onde uma doença particular (por exemplo, doença inflamatória ou autoimune) ou um tumor específico (por exemplo, CTCL) são mencionados ao invés de “doença proliferativa”, as categorias de um) até e) também são abrangidas, significando que a doença respectiva pode ser depositada sob a) até e) acima ao invés de “doença proliferativa”, de acordo com a matéria objeto patenteável.
[00110] Os termos “câncer” e “tumor” como aqui usados são definidos como um novo crescimento de células ou tecido compreendendo multiplicação descontrolada e progressiva. Em uma forma de realização específica, em um curso natural o câncer é fatal. Em formas de realização específicas, um câncer é invasivo, metastático, e/ou anaplástico (perda de diferenciação e de orientação de um para outro e para sua matriz axial).
[00111] Distúrbios “autoimunes” include qualquer distúrbio, condição, ou doença em que o sistema imune monta uma reação contra as próprias células ou tecidos, devido a uma avaria na capacidade para distinguir os próprios dos não próprios ou de outro modo. Os exemplos de distúrbios autoimunes incluem artrite reumatóide, vasculite reumatóide, lupo eritematoso sistêmico, esclerose múltipla, granulomatose de Wegener, espondiloartrite, e outros. Um “distúrbio inflamatório” inclui qualquer distúrbio caracterizado por uma resposta imune não desejada. Os distúrbios autoimunes e inflamatórios podem envolver qualquer componente do sistema imune, e pode alvejar qualquer tipo de célula ou tecido no corpo.
[00112] O termo “biopsia” como aqui usado é definido como a remoção de um tecido de um órgão (por exemplo, uma junta) for para o propósito de examinação, tal como para estabelecer diagnóstico. Os exemplos de tipos de biopsias incluem pela aplicação de sucção, tal como através de uma agulha ligada a uma seringa; pela remoção instrumental de um fragmento de tecido; pela remoção com instrumentos apropriados através de uma endoscopia; pela excisão cirúrgica, tal como da lesão total; e os seus semelhantes.
[00113] O termo “anticorpo,” como aqui usado, refere-se a anticorpos policlonais e monoclonais. Dependendo do tipo de domínio constante nas cadeias pesadas, os anticorpos são designados a uma das cinco classes principais: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM. Várias destas são divididas ainda em subclasses ou isótipos, tais como IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, e os seus semelhantes. Uma unidade estrutural da imunoglobulina exemplar (anticorpo) compreende um tetrâmero. Cada tetrâmero é composto de dois pares idênticos de cadeias de polipeptídeo, cada par tendo uma cadeia “leve” (de cerca de 25 kDa) e uma “pesada” (de cerca de 5070 kDa). O terminal N de cada cadeia define uma X região variável de cerca de 100 a 110 ou mais aminoácidos isto é primariamente responsivo ao reconhecimento de antígeno. Os termos cadeia variável leve (VL) e cadeia variável pesada (VH) referem-se a estas cadeias leve e pesada respectivamente. Os domínios constantes de cadeia pesada que correspondem às classes diferentes de imunoglobulinas são chamados de alfa,” “delta,” “épsilon,” “gama” e “mu,” respectivamente. As estruturas da subunidade e configurações tridimensionais de classes diferentes de imunoglobulinas são bem conhecidas. IgG e/ou IgM são as classes preferidas de anticorpos aqui usadas, com IgG sendo particularmente preferido, porque eles são os anticorpos mais preferidos na situação fisiológica e porque eles são mais facilmente fabricados em um ambiente de laboratório. Preferivelmente o anticorpo é um anticorpo monoclonal. Os anticorpos particularmente preferidos são humanizados, quiméricos, humanos, ou de outro modo adequados para o ser humano. “Anticorpos” também inclui qualquer fragmento ou derivado de qualquer um dos anticorpos aqui descritos.
[00114] O termo “liga-se especificamente a” significa que um anticorpo pode se ligar preferivelmente em um ensaio de ligação competitiva ao parceiro de ligação, por exemplo, KIR3DL2, como avaliado usando formas recombinantes das proteínas, epítopos nestas, ou proteínas nativas presentes na superfície de células alvo isoladas. Os ensaios de ligação competitiva e outros métodos para determinar ligação específica são descritos ainda abaixo e são bem conhecidos na técnica.
[00115] Quando um anticorpo é dito “competir com” um anticorpo monoclonal particular (por exemplo, 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 ou 20E9), significa que o anticorpo compete com o anticorpo monoclonal em um ensaio de ligação usando moléculas de KIR3DL2 recombinantes ou moléculas de KIR3DL2 expressadas na superfície. Por exemplo, se um anticorpo de teste reduz a ligação de 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 ou 20E9 a um polipeptídeo KIR3DL2 ou célula que expressa KIR3DL2 em um ensaio de ligação, o anticorpo é dito “competir” respectivamente com 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 ou 20E9.
[00116] O termo “afinidade”, como aqui usado, significa que a força da ligação de um anticorpo a um epítopo. A afinidade de um anticorpo é dada pela constante de dissociação Kd, definida como [Ab] x [Ag] / [Ab-Ag], onde [Ab-Ag] é a concentração molar do complexo anticorpo-antígeno, [Ab] é a concentração molar do anticorpo não ligado e [Ag] é a concentração molar do antígeno não ligado. A constante afinidade de Ka é definida por 1/Kd. Os exemplos de métodos para determinar a afinidade de mAbs podem ser encontrados em Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque., 1988), Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. e Wiley Interscience, Nova Iorque., (1992, 1993), e Muller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983), referências estas que são aqui totalmente incorporadas por referência. Um método padrão bem conhecido na técnica para determinar a afinidade de mAbs é o uso de triagem pela ressonância de plásmon de superfície (SPR) (tal como pela análise com um Dispositivo analítico de SPR da BIAcore®).
[00117] Como aqui usado, um “determinante” designa um sítio de interação ou ligação em um polipeptídeo.
[00118] O termo “epítopo” refere-se a um determinante antigênico, e é a área ou a região em um antígeno à qual um anticorpo se liga. Um epítopo de proteína pode compreender resíduos de aminoácido diretamente envolvido na ligação assim como resíduos de aminoácido que são efetivamente bloqueados pelo anticorpo de ligação de antígeno específico ou peptídeo, isto é, resíduos de aminoácido dentro da “pegada” do anticorpo. É a forma mais simples ou área estrutural menor em uma molécula de antígeno complexa que pode combinar com por exemplo, um anticorpo ou um receptor. Os epítopos podem ser lineares ou conformacionais/estruturais. O termo “epítopo linear” é definido como um epítopo composto de resíduos de aminoácido que são contíguos na sequência linear de aminoácidos (estrutura primária). O termo “epítopo conformacional ou estrutural” é definido como um epítopo composto de resíduos de aminoácido que não são todos contíguos e assim representam partes separadas da sequência linear de aminoácidos que são levados em proximidade um do outro pela dobra da molécula (estruturas secundária, terciária e/ou quaternária). Um epítopo conformacional é dependente na estrutura 3-dimensional. O termo 'conformacional' é portanto frequentemente usado intercambiavelmente com 'estrutural'.
[00119] Os termos “internalização intracelular”, ou “internalização” quando da alusão a um polipeptídeo KIR3DL2 e/ou anticorpo que liga tais, referem-se aos eventos moleculares, bioquímicos e celulares associados com o processo de translocação de uma molécula da superfície extracelular de uma célula para a superfície intracelular de uma célula. Os processos responsivos pela internalização intracelular de moléculas são bem conhecidos e podem envolver, inter alia, a internalização das moléculas extracelulares (tais como hormônios, anticorpos, e moléculas orgânicas pequenas); moléculas associadas com membrana (tais como receptores de superfície celular); e complexos de moléculas associadas com membrana ligadas às moléculas extracelulares (por exemplo, um ligando ligado a um receptor de transmembrana ou um anticorpo ligado a um molécula associada com membrana). Assim, “induzir e/ou aumentar internalização intracelular” compreende eventos em que a internalização intracelular é iniciada e/ou a taxa e/ou extensão de internalização intracelular é aumentada.
[00120] O termo “esgotamento”, com respeito às células que expressam KIR3DL2 significa um processo, método, ou composto que podem matar, eliminar, lise ou induzir tal matança, eliminação ou lise, assim como para afetar negativamente o número de células que expressam KIR3DL2 presente em uma amostra ou em um indivíduo.
[00121] O termo “agente” é aqui usado para indicar um composto químico, uma mistura de compostos químicos, uma macromolécula biológica, ou um extrato fabricado a partir de materiais biológicos. O termo “agente terapêutico” refere-se a um agente que tem atividade biológica.
[00122] Os termos “agente tóxico” e “agente citotóxico” abrange qualquer composto que pode diminuir, parar, ou reverter a proliferação de células, diminui a sua atividade em qualquer via detectável, ou direta ou indiretamente matando- os. Preferivelmente, os agentes citotóxicos causam a morte da célula primariamente interferindo diretamente com o funcionamento da célula, e incluem, mas não são limitados a, agentes de alquilação, inibidores do fator de necrose de tumor, intercaladores, inibidores de microtúbulo, inibidores de cinase, inibidores de proteassoma e inibidores de topoisomerase. Uma “carga tóxica” como aqui usado refere-se a uma quantidade suficiente de agente citotóxico que, quando liberada a uma célula resulta na morte da célula. A liberação de uma carga tóxica pode ser realizada pela administração de uma quantidade suficiente de imunoconjugado compreendendo um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno e um agente citotóxico. A liberação de uma carga tóxica também pode ser realizada pela administração de uma quantidade suficiente de um imunoconjugado compreendendo um agente citotóxico, em que o imunoconjugado compreende um anticorpo secundário ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo que reconhecem e ligam um anticorpo ou fragmento de ligação de antígeno.
[00123] Para os propósitos aqui, um anticorpo “humanizado” ou “humano” refere-se a um anticorpo em que a região de matriz constante e variável de uma ou mais imunoglobulinas humanas é fundida com a região de ligação, por exemplo, a CDR, de uma imunoglobulina animal. Tais anticorpos são designados manter a especificidade de ligação do anticorpo não humano do qual as regiões de ligação são derivadas, mas para evitar uma reação imune contra o anticorpo não humano. Tais anticorpos podem ser obtidos a partir de camundongos transgênicos ou outros animais que foram “engendrados” para produzirem anticorpos humanos específicos em resposta à inoculação antigênica (ver, por exemplo, Green et al. (1994) Nature Genet 7:13; Lonberg et al. (1994) Nature 368:856; Taylor et al. (1994) Int Immun 6: 579, as divulgações totais das quais são aqui incorporadas por referência). Um anticorpo totalmente humano também pode ser construído pelos métodos de transfecção genética ou cromossômica, assim como tecnologia de demonstração de fago, todos os quais são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-553). Os anticorpos humanos também podem ser gerados in vitro pelas células B ativadas (ver, por exemplo, as Pat. U.S. Nos. 5.567.610 e 5.229.275, que são incorporadas na sua totalidade por referência).
[00124] Um “anticorpo quimérico” é uma molécula de anticorpo em que (a) a região constante, ou uma porção da mesma, é alterada, substituída ou trocada de modo que o sítio de ligação de antígeno (região variável) seja ligado a uma região constante de uma classe, função efetora e/ou espécie diferentes ou alteradas, ou uma molécula totalmente diferente que confere novas propriedades ao anticorpo quimérico, por exemplo, uma enzima, toxina, hormônio, fator de crescimento, medicamento, etc.; ou (b) a região variável, ou uma porção da mesma, é alterada, substituída ou trocada com uma região variável tendo uma especificidade de antígeno diferente ou alterada.
[00125] Os termos “domínio Fc,” “porção Fc,” e “região Fc” referem-se a um fragmento de terminal C de uma cadeia pesada de anticorpo, por exemplo, de cerca de 230 a cerca de aa 450 aminoácido (aa) da cadeia pesada (gama) humana ou a sua sequência de contraparte em outros tipos de cadeias pesadas de anticorpo (por exemplo, α, β, ε e μ para anticorpos humanos), ou um alotipo dos mesmos que ocorra naturalmente. A menos que de outro modo especificado, a numeração de aminoácido de Kabat habitualmente aceita para as imunoglobulinas é usada por toda esta divulgação (ver Kabat et al. (1991) Sequences of Protein of Immunological Interest, 5a ed., United States Public Health Service, National Institute of Health, Bethesda, MD).
[00126] O termo “citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo” ou “ADCC” é um termo bem entendido na técnica, e refere-se a uma reação mediada por célula em que células citotóxicas não específicas que expressam receptores Fc (FcRs) reconhecem anticorpo ligado em uma célula alvo e subsequentemente causa a lise da célula alvo. As células citotóxicas não específicas que medeiam ADCC incluem as células matadoras naturais (NK), macrófagos, monócitos, neutrófilos, e eosinófilos.
[00127] Os termos “isolado”, “purificado” ou “biologicamente puro” referem-se ao material que é substancial ou essencialmente isento de componentes que normalmente acompanham o mesmo como encontrado no seu estado nativo. A pureza e homogeneidade são tipicamente determinadas usando técnicas de química analítica tais como eletroforese em gel de poliacrilamida ou cromatografia líquida de alto desempenho. Uma proteína que é a espécie predominante presente em uma preparação é substancialmente purificada.
[00128] Os termos “polipeptídeo,” “peptídeo” e “proteína” são aqui usados intercambiavelmente para se referir a um polímero dos resíduos de aminoácido. Os termos aplicam-se aos polímeros de aminoácido em que um ou mais resíduos de aminoácido são um mimético químico artificial de um aminoácido que ocorre naturalmente correspondente, assim como aos polímeros de aminoácido que ocorrem naturalmente e que não ocorrem naturalmente.
[00129] O termo “recombinante” quando usado com referência, por exemplo, a uma célula, ou ácido nucléico, proteína, ou vetor, indica que a célula, ácido nucléico, proteína ou vetor, foram modificados pela introdução de um ácido nucléico ou proteína heterólogo ou a alteração de um ácido nucléico ou proteína nativos, ou que a célula é derivada de uma célula assim modificada. Assim, por exemplo, os genes expressam células recombinantes que não são encontradas dentro da forma nativa (não recombinante) da célula ou expressam genes nativos que são de outro modo anormalmente expressados, sob expressado ou não expressado de modo algum.
[00130] O termo “modificação” quando da referencia a uma sequência de aminoácidos (por exemplo, “modificação de aminoácido”), é intencionado uma substituição, inserção, e/ou deleção de aminoácido em uma sequência de polipeptídeo. Por “modificação” ou “modificação de aminoácido” é intencionado uma substituição, inserção, e/ou deleção de aminoácido em uma sequência de polipeptídeo. Por “substituição de aminoácido” ou “substituição” aqui é intencionado a substituição de um aminoácido em uma dada posição em uma sequência de proteína com um outro aminoácido. Por exemplo, a substituição P14S refere-se a uma variante de um polipeptídeo precursor, em que a prolina na posição 14 é substituída com serina. Uma “variante” de um polipeptídeo refere-se a um polipeptídeo tendo uma sequência de aminoácido que é substancialmente idêntica a um polipeptídeo de referência, tipicamente um polipeptídeo nativo ou “precursor”. A variante de polipeptídeo pode possuir uma ou mais substituições, deleções, e/ou inserções de aminoácido em certas posições dentro da sequência de aminoácido nativa.
[00131] Como aqui usado, “células T” refere-se a uma subpopulação de linfócitos que maturam no timo, e que demonstram, entre outras moléculas receptores de célula T na sua superfície. As células T podem ser identificadas em virtude de certas características e propriedades biológicas, tais como a expressão de antígenos de superfície específicos incluindo o TCR, CD4 ou CD8, opcionalmente CD4 e IL-23R, a capacidade de certas células T para matar tumor ou células infectadas, a capacidade de certas células T para ativar outras células do sistema imune, e a capacidade para liberar moléculas de proteína chamadas de citocinas que estimulam ou inibem a resposta imune. Qualquer uma destas características e atividades podem ser usadas para identificar células T, usando métodos bem conhecidos na técnica. Como aqui usado, células T “ativas” ou “ativadas” designam células T biologicamente ativas, mais particularmente células T tendo a capacidade de citólise ou de estimular uma resposta imune, por exemplo, pela secreção de citocinas. As células ativas podem ser detectadas em qualquer um de vários métodos bem conhecidos, incluindo ensaios funcionais e ensaios com base na expressão tais como a expressão de citocinas tais como TNF-alfa ou IL-17A.
[00132] Como aqui usado, o termo anticorpo que “liga” um polipeptídeo ou epítopo designa um anticorpo que liga o dito determinante com especificidade e/ou afinidade.
Anticorpos e epítopos
[00133] Os anticorpos divulgados são anticorpos que ligam KIR3DL2 humano. em uma forma de realização, os anticorpos seletivamente ligam KIR3DL2 (por exemplo, o 1, 2, 3, 4 ou o mais predominante dos alelos de KIR3DL2) e não se ligam a KIR3DL1 (por exemplo, o 1, 2, 3, 4 ou o mais predominante dos alelos KIR3DL1). Em uma forma de realização, os anticorpos se ligam ao domínio D0 de KIR3DL2 que corresponde aos resíduos de aminoácido de 1 a 98 do polipeptídeo KIR3DL2 da SEQ ID NO: 1. Em uma forma de realização, os anticorpos se ligam ao domínio D2 de KIR3DL2, ou a uma região que abrange tanto o domínio D1 quanto o D2 (no limite dos domínios D1 e D2), do polipeptídeo KIR3DL2 da SEQ ID NO: 1. Em uma forma de realização, os anticorpos têm uma afinidade para KIR3DL2 humano caracterizada por um KD de menos do que 10-9 M, preferivelmente menos do que 10-10 M.
[00134] Em uma outra forma de realização, os anticorpos se ligam substancialmente ao mesmo epítopo como os anticorpos 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 ou 20E9. Em outra forma de realização, os anticorpos pelo menos parcialmente se sobrepõem, ou incluem pelo menos um resíduo no segmento que corresponde aos resíduos de 1 a 98 ou resíduos de 193 a 292 do polipeptídeo KIR3DL2 da SEQ ID NO: 1 (ou uma subsequência do mesmo. Em uma forma de realização, todos os resíduos chave do epítopo estão em um segmento que corresponde aos resíduos de 1 a 98. Em uma forma de realização, o anticorpo se liga a um resíduo presente no domínio D1 assim como um resíduo presente no domínio D2; opcionalmente um ou mais resíduos chave está no limite dos domínios D1 (resíduos de 99 a 192) e D2 (resíduos de 193 a 292). Em uma forma de realização, os anticorpos se ligam a um epítopo compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais resíduos no segmento que corresponde aos resíduos de 1 a 98, de 99 a 292, de 99 a 192, ou de 193 a 292 do polipeptídeo KIR3DL2 da SEQ ID NO: 1. Preferivelmente os resíduos ligados pelo anticorpo estão presentes na superfície do polipeptídeo KIR3DL2.
[00135] Em uma forma de realização, os anticorpos se ligam a um epítopo compreendendo os resíduos R13, A25, e/ou Q27. Opcionalmente, os anticorpos se ligam a um epítopo compreendendo os resíduos R13, A25, e/ou Q27, também os resíduos I60 e/ou G62. Opcionalmente, os anticorpos não se ligam aos resíduos H32 e/ou H33. Opcionalmente, os anticorpos se ligam ainda aos resíduos Q56 e/ou E57.
[00136] Em uma forma de realização, os anticorpos se ligam a um epítopo compreendendo os resíduos I60 e/ou G62. Opcionalmente, os anticorpos se ligam a um epítopo compreendendo um ou mais dos resíduos I60 e/ou G62, mas não resíduos R13, A25, e/ou Q27.
[00137] Em uma forma de realização, os anticorpos se ligam a um epítopo compreendendo um ou mais dos resíduos I60 e/ou G62 assim como um ou mais dos resíduos P14, S15 e/ou H23. Opcionalmente, os anticorpos se ligam a um epítopo compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dos resíduos G21, G22, H23, E57, S58, F59, P63 e/ou H68.
[00138] Opcionalmente, os anticorpos se ligam a um epítopo compreendendo um ou mais dos resíduos R78 e/ou L82. Opcionalmente, os anticorpos se ligam a um epítopo compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dos resíduos K7, Y30, R31, P79, H80, S81, T83, G84, W85, S86 e/ou A87.
[00139] Opcionalmente, os anticorpos se ligam a um epítopo compreendendo o resíduo W226. Opcionalmente, os anticorpos se ligam a um epítopo compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dos resíduos Q201, K202, P203, S204, S224, S225, S227, S228, N252, R253 e/ou T254.
[00140] Opcionalmente, os anticorpos se ligam a um epítopo compreendendo um ou mais dos resíduos I231 e/ou R246. Opcionalmente, os anticorpos se ligam a um epítopo compreendendo os resíduos I231 e/ou R246 assim como a um epítopo compreendendo o resíduo W226. Opcionalmente, os anticorpos se ligam a um epítopo compreendendo 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dos resíduos D230, I231, R244, L245, R246, A247, V248, S275, R277 e/ou P280.
[00141] Opcionalmente, os anticorpos se ligam a um epítopo compreendendo o resíduo E239. Opcionalmente, os anticorpos se ligam ainda a um ou mais dos resíduos I231 e/ou R246. Opcionalmente, os anticorpos se ligam ainda ao resíduo W226.
[00142] A seção de exemplos aqui descreve a construção de uma série de polipeptídeos KIR3DL2 humanos mutantes. A ligação do anticorpo anti-KIR3DL2 às células transfectadas com os mutantes KIR3DL2 foi medida e comparada com a capacidade do anticorpo anti-KIR3DL2 para ligar polipeptídeo KIR3DL2 do tipo selvagem (SEQ ID NO: 1). Uma redução na ligação entre um anticorpo anti- KIR3DL2 e um polipeptídeo KIR3DL2 mutante como aqui usado significa que existe uma redução na afinidade de ligação (por exemplo, como medido pelos métodos conhecidos tais o teste FACS de células que expressam um mutante particular, ou pelo teste Biacore da ligação aos polipeptídeos mutantes) e/ou uma redução na capacidade de ligação total do anticorpo anti-KIR3DL2 (por exemplo, como evidenciado por uma diminuição em Bmax em uma plotagem da concentração de anticorpo anti-KIR3DL2 versus a concentração de polipeptídeo). Uma redução significante na ligação indica que o resíduo mutado está diretamente envolvido na ligação ao anticorpo anti-KIR3DL2 ou está em proximidade imediata à proteína de ligação quando o anticorpo anti-KIR3DL2 está ligado a KIR3DL2. Um epítopo de anticorpo assim preferivelmente incluirá tal resíduo e pode incluir resíduos adicionais adjacentes a tal resíduo.
[00143] Em algumas formas de realização, uma redução significante na ligação significa que a afinidade e/ou capacidade de ligação entre um anticorpo anti-KIR3DL2 e um polipeptídeo KIR3DL2 mutante é reduzida em mais do que 40 %, mais do que 50 %, mais do que 55 %, mais do que 60 %, mais do que 65 %, mais do que 70 %, mais do que 75 %, mais do que 80 %, mais do que 85 %, mais do que 90% ou mais do que 95 % em relação à ligação entre o anticorpo e um polipeptídeo KIR3DL2 do tipo selvagem (por exemplo, o polipeptídeo mostrado na SEQ ID NO: 1). Em certas formas de realização, a ligação é reduzida abaixo de limites detectáveis. Em algumas formas de realização, uma redução significante na ligação é evidenciada quando a ligação de um anticorpo anti-KIR3DL2 a um polipeptídeo KIR3DL2 mutante é menor do que 50 % (por exemplo, menor do que 45 %, 40 %, 35 %, 30 %, 25 %, 20 %, 15 % ou 10 %) da ligação observada entre o anticorpo anti-KIR3DL2 e um polipeptídeo KIR3DL2 do tipo selvagem (por exemplo, o domínio extracelular mostrado na SEQ ID NO: 1). Tais medições de ligação podem ser feitas usando uma variedade de ensaios de ligação conhecidas na técnica. Um exemplo específico de um tal ensaio é descrito na seção de Exemplo.
[00144] Em algumas formas de realização, anticorpos anti-KIR3DL2 são fornecidos que exibem ligação significantemente mais baixa a um polipeptídeo KIR3DL2 mutante em que um resíduo em um polipeptídeo KIR3DL2 do tipo selvagem (por exemplo, SEQ ID NO:1) é substituído. Na notação resumida aqui usada, o formato é: Resíduo do tipo selvagem: Posição no polipeptídeo: Resíduo mutante, com a numeração dos resíduos como indicado na SEQ ID NO: 1.
[00145] Em algumas formas de realização, um anticorpo anti-KIR3DL2 liga um polipeptídeo KIR3DL2 do tipo selvagem mas tem ligação diminuída a um polipeptídeo KIR3DL2 mutante tendo qualquer um ou mais das seguintes mutações (com referência à SEQ ID NO: 1): (a) R13W, A25T e/ou G25R; (b) I60N e/ou G62S; (c) P14S, S 15A e/ou H23S; (d) um ou mais de R13W, A25T e/ou G25R, e um ou mais de I60N e/ou G62S; (e) um ou mais de P145, S15A e/ou H23S, e um ou mais de I60N e/ou G62S; (f) um ou mais de R13W, A25T e/ou G25R, um ou mais de I60N e/ou G62S; e um ou mais de P145, S15A e/ou H23S; (g) um ou mais de P145, S15A e/ou H23S, e um ou mais de I60N e/ou G62S; (h) R78H e/ou L82P; (i) W226A; (j) I231M e/ou R246P; (k) um ou mais de I231M e/ou R246P, e adicionalmente W226A; ou (l) um ou mais de I231M e/ou R246P, mas em que o anticorpo não tem ligação diminuída a um mutante que tem uma mutação em W226A.
[00146] Preferivelmente a ligação ao(s) mutante(s) particular(es) de KIR3DL2 é significantemente reduzida comparada com a ligação ao KIR3DL2 tipo selvagem.
[00147] Produção de Anticorpos Anti-KIR3DL2
[00148] Os anticorpos podem ser produzidos por uma variedade de técnicas conhecidas na técnica. Tipicamente, eles são produzidos pela imunização de um animal não humano, preferivelmente um camundongo, com um imunógeno compreendendo um polipeptídeo KIR3DL2, preferivelmente um polipeptídeo KIR3DL2 humano. O polipeptídeo KIR3DL2 pode compreender a sequência de tamanho natural de um polipeptídeo KIR3DL2 humano, ou um fragmento ou derivado da mesma, tipicamente um fragmento imunogênico, isto é, uma porção do polipeptídeo compreendendo um epítopo exposto na superfície de células que expressam um polipeptídeo KIR3DL2, preferivelmente o epítopo reconhecido pelos anticorpos 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 ou 20E9. Tais fragmentos tipicamente contêm pelo menos cerca de 7 aminoácidos consecutivos da sequência de polipeptídeo maduro, ainda mais preferivelmente pelo menos cerca de 10 aminoácidos consecutivos do mesmo. Os fragmentos de modo típico são essencialmente derivados do domínio extracelular do receptor. Em uma forma de realização, o imunógeno compreende um polipeptídeo KIR3DL2 humano do tipo selvagem em uma membrana lipídica, tipicamente na superfície de uma célula. Em uma forma de realização específica, o imunógeno compreende células intactas, particularmente células humanas intactas, opcionalmente tratadas ou lisadas. Em outra forma de realização, o polipeptídeo é um polipeptídeo KIR3DL2 recombinante. Em uma forma de realização específica, o imunógeno compreende células SS ou MF intactas, particularmente células T CD4+, ou células T CD4+CD28- malignas humanas intactas, opcionalmente tratadas ou lisadas. Em outra forma de realização, o polipeptídeo é um polipeptídeo KIR3DL2 dimérico recombinante.
[00149] A etapa de imunizar um mamífero não humano com um antígeno pode ser realizada em qualquer maneira bem conhecida na técnica para estimular a produção de anticorpos em um camundongo (ver, por exemplo, E. Harlow e D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988), a divulgação inteira da qual é aqui incorporada por referência). O imunógeno é colocado em suspensão ou dissolvido em um tampão, opcionalmente com um adjuvante, tal como adjuvante de Freund completo ou incompleto. Métodos para determinar a quantidade de imunógeno, tipos de tampões e quantidades de adjuvante são bem conhecidos por aqueles de habilidade na técnica. Estes parâmetros podem ser diferentes para imunógenos diferentes, mas são facilmente elucidados.
[00150] Similarmente, a localização e frequência de imunização suficiente para estimular a produção de anticorpos também são bem conhecidas na técnica. em um protocolo de imunização típico, os animais não humanos são injetados intraperitonealmente com antígeno no dia 1 e mais uma vez a cerca de uma semana mais tarde. Isto é seguido pelo retorno das injeções do antígeno em torno do dia 20, opcionalmente com um adjuvante tal como adjuvante de Freund incompleto. O retorno das injeções é realizado intravenosamente e pode ser repetido por vários dias consecutivos. Isto é seguido por uma injeção de reforço no dia 40, intravenosa ou intraperitonealmente, de modo típico sem adjuvante. Este protocolo resulta na produção de células B que produzem anticorpo específico de antígeno depois de cerca de 40 dias. Outros protocolos também podem ser usados contanto que eles resultem na produção de células B que expressam um anticorpo direcionado ao antígeno usado na imunização.
[00151] Para a preparação de anticorpo policlonal, soro é obtido de um animal não humano imunizado e os anticorpos aí presentes isolados pelas técnicas bem conhecidas. O soro pode ser purificado por afinidade usando qualquer um dos imunógenos apresentados acima ligados a um suporte sólido de modo a obter anticorpos que reagem com os polipeptídeos KIR3DL2.
[00152] Em uma forma de realização alternativa, linfócitos de um mamífero não humano não imunizado são isolados, cultivados in vitro, e depois expostos ao imunógeno em cultura de célula. Os linfócitos são depois colhidos e a etapa de fusão descrita abaixo é realizada.
[00153] Para os anticorpos monoclonais, a etapa seguinte é a isolação de esplenócitos do mamífero não humano imunizado e a fusão subsequente destes esplenócitos com uma célula imortalizada de modo a formar um hibridoma que produz anticorpo. A isolação de esplenócitos de um mamífero não humano é bem conhecida na técnica e tipicamente envolve remover o baço de um mamífero não humano anestesiado, cortá-lo em pedaços pequenos e espremer os esplenócitos da cápsula esplênica através de uma malha de náilon de uma peneira de célula em um tampão apropriado de modo a produzir uma suspensão de célula. As células são lavadas, centrifugadas e recolocadas em suspensão em um tampão que lise qualquer uma das células sanguíneas vermelhas. A solução é novamente centrifugada e os linfócitos remanescentes no grânulo são finalmente recolocados em suspensão em tampão fresco.
[00154] Uma vez isolados e presentes na suspensão de célula única, os linfócitos podem ser fundidos a uma linhagem de célula imortal. Esta é tipicamente uma linhagem de célula de mieloma de camundongo, embora muitas outras linhagens de célula imortal úteis para criar hibridomas sejam conhecidas na técnica. As linhagens de mieloma de murinho incluem, mas não são limitadas àquelas derivadas de tumores de camundongo MOPC-21 e MPC-11 disponíveis do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, U. S. A., às células X63 Ag8653 e SP-2 disponíveis da American Type Culture Collection, Rockville, Maryland U. S. A. A fusão é efetuada usando polietileno glicol ou os seus semelhantes. Os hibridomas resultantes são depois cultivadas em meio seletivo que contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células de mieloma não fundidas, precursoras. Por exemplo, se as células de mieloma precursoras carecem da enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas tipicamente incluirão hipoxantina, aminopterina, e timidina (meio HAT), substâncias estas que previnem o crescimento de células deficientes em HGPRT.
[00155] Os hibridomas são tipicamente cultivados em uma camada alimentadora de macrófagos. Os macrófagos são preferivelmente de irmãos de ninhada do mamífero não humano usado para isolar esplenócitos e são tipicamente iniciados com adjuvante de Freund incompleto ou os seus semelhantes vários dias antes de plaquear os hibridomas. Os métodos de fusão são descritos em Goding, “Monoclonais Antibodies: Principles and Practice,” pp. 59103 (Academic Press, 1986), a divulgação da qual é aqui incorporada por referência.
[00156] As células são deixadas crescer no meio de seleção por tempo suficiente para a formação de colônia e produção de anticorpo. Isto está usualmente entre cerca de 7 e cerca de 14 dias.
[00157] As colônias de hibridoma são depois ensaiadas quanto à produção de anticorpos que especificamente se ligam aos produtos de gene de polipeptídeo KIR3DL2, opcionalmente o epítopo especificamente é reconhecido pelo anticorpo 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 ou 20E9. O ensaio é tipicamente um ensaio tipo ELISA colorimétrico, embora qualquer ensaio possa ser utilizado que pode ser adaptado para os reservatórios dentro dos quais os hibridomas são cultivados. Outros ensaios incluem radioimunoensaios ou classificação de célula ativada pela fluorescência. Os reservatórios positivos para a produção de anticorpo desejada são examinados para determinar se uma ou mais colônias distintas estão presentes. Se mais do que uma colônia está presente, as células podem ser re-clonadas e cultivadas para garantir que apenas uma única célula tenha dado origem à colônia que produz o anticorpo desejado.
[00158] Os hibridomas que são confirmados produzir um anticorpo monoclonal adequado podem ser cultivados em quantidades maiores em um meio apropriado, tal como DMEM ou RPMI-1640. Alternativamente, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores de ascite em um animal.
[00159] Depois de cultivo suficiente para produzir o anticorpo monoclonal desejado, o meio de cultivo contendo anticorpo monoclonal (ou o fluido de ascite) é separado das células e o anticorpo monoclonal aí presente é purificado. A purificação é tipicamente obtida pela eletroforese em gel, diálise, cromatografia usando proteína A ou proteína G-Sepharose, ou uma Ig anti-camundongo ligada a um suporte sólido tal como pérolas de agarose ou Sepharose (todas descritas, por exemplo, no Antibody Purification Handbook, Biosciences, publicação No. 18-1037-46, Edição AC, a divulgação da qual é por meio deste incorporada por referência). O anticorpo ligado é tipicamente eluído das colunas de proteína A/proteína G usando-se tampões de pH baixo (tampões de glicina ou acetato de pH 3,0 ou menos) com neutralização imediata de frações contendo anticorpo. Estas frações são reunidas, dialisadas, e concentradas como necessário.
[00160] Os reservatórios positivos com uma única colônia aparente são tipicamente re-clonados e re-ensaiados para garantir que apenas um anticorpo monoclonal esteja sendo detectado e produzido.
[00161] Anticorpos também podem ser produzidos pela seleção de bibliotecas combinatórias de imunoglobulinas, como divulgado por exemplo em (Ward et al. Nature, 341 (1989) p. 544, a divulgação completa da qual é aqui incorporada por referência).
[00162] A identificação de um ou mais anticorpos que se ligam ao KIR3DL2, de modo particularmente substancial ou essencial o mesmo epítopo como o anticorpo monoclonal 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 ou 20E9, pode ser facilmente determinado usando qualquer um de uma variedade de ensaios de triagem imunológica em que a competição de anticorpo pode ser avaliada. Muitos de tais ensaios são rotineiramente praticados e são bem conhecidos na técnica (ver, por exemplo, a Pat. U. S. No. 5.660.827, que é especificamente aqui incorporada por referência). Será entendido que de fato determinar o epítopo ao qual um anticorpo aqui descrito se liga não é de nenhum modo requerido para identificar um anticorpo que se liga ao mesmo ou substancialmente o mesmo epítopo como o anticorpo monoclonal aqui descrito.
[00163] Por exemplo, onde os anticorpos de teste a serem examinados são obtidos de animais fonte diferentes, ou são ainda de um isótipo de Ig diferente, um ensaio de competição simples pode ser utilizado em que o controle (10F6, por exemplo para propósitos de ilustração, ou qualquer outro anticorpo tal como 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 ou 20E9) e anticorpos de teste são misturados (ou pré-adsorvidos) e aplicados a uma amostra contendo polipeptídeos KIR3DL2. Os protocolos com base no western blotting e o uso da análise de BIACORE são adequados para o uso em tais estudos de competição.
[00164] Em certas formas de realização, pré-mistura-se os anticorpos de controle (10F6, por exemplo, embora qualquer outro dos anticorpos ) com quantidades variáveis dos anticorpos de teste (por exemplo, cerca de 1:10 ou cerca de 1:100) por um período de tempo antes da aplicação à amostra de antígeno KIR3DL2. Em outras formas de realização, o controle e quantidades variáveis de anticorpos de teste podem ser simplesmente misturados durante a exposição à amostra de antígeno de KIR3DL2. Contanto que possa se distinguir os anticorpos ligados dos livres (por exemplo, usando-se as técnicas de separação ou lavagem para eliminar anticorpos não ligados) e (10F6 dos anticorpos de teste (por exemplo, usando-se anticorpos secundários específicos de espécie ou específicos de isótipo ou especificamente rotulando-se 10F6 com um rótulo detectável) pode-se determinar se os anticorpos de teste reduzem a ligação de 10F6 aos antígenos, indicando que o anticorpo de teste reconhece substancialmente o mesmo epítopo como 10F6. A ligação dos anticorpos de controle (rotulados) na ausência de um anticorpo completamente irrelevante pode servir como o valor de controle alto. O valor de controle baixo pode ser obtido incubando-se os anticorpos rotulados (10F6) com anticorpos não rotulados exatamente do mesmo tipo (10F6), onde a competição ocorreria e reduziria a ligação dos anticorpos rotulados. Em um ensaio de teste, uma redução significante na reatividade de anticorpo rotulado na presença de um anticorpo de teste é indicativa de um anticorpo de teste que reconhece substancialmente o mesmo epítopo, isto é, um que “reage cruzado” ou compete com o anticorpo rotulado (10F6). Qualquer anticorpo de teste que reduz a ligação de 10F6 aos antígenos de KIR3DL2 em pelo menos cerca de 50 %, tal como pelo menos cerca de 60 %, ou mais preferivelmente pelo menos cerca de 80 % ou 90 % (por exemplo, cerca de 65 a 100 %), em qualquer razão de 10F6:anticorpo de teste entre cerca de 1:10 e cerca de 1:100 é considerado ser um anticorpo que se liga substancialmente ao mesmo epítopo ou determinante como 10F6. Preferivelmente, tal anticorpo de teste reduzirá a ligação de 10F6 ao antígeno de KIR3DL2 em pelo menos cerca de 90 % (por exemplo, cerca de 95 %).
[00165] A competição também pode ser avaliada, por exemplo, por um teste de citometria de fluxo. Em um tal teste, as células que carregam um dado polipeptídeo KIR3DL2 podem ser incubados primeiro com 10F6, por exemplo, e depois com o anticorpo de teste rotulados com um fluorocromo ou biotina. O anticorpo é dito competir com 10F6 se a ligação obtida na pré-incubação com uma quantidade saturante de 10F6 for de cerca de 80 %, preferivelmente cerca de 50 %, cerca de 40 % ou menos (por exemplo, em torno de 30 %, 20 % ou 10 %) da ligação (como medido pela média da fluorescência) obtida pelo anticorpo sem pré-incubação com 10F6. Alternativamente, um anticorpo é dito competir com 10F6 se a ligação obtida com um anticorpo 10F6 rotulado (por um fluorocromo ou biotina) nas células pré-incubadas com uma quantidade saturante de anticorpo de teste é de cerca de 80 %, preferivelmente cerca de 50 %, cerca de 40 %, ou menos (por exemplo, em torno de 30 %, 20 % ou 10 %) da ligação obtida sem pré-incubação com o anticorpo de teste.
[00166] Um ensaio de competição simples em que um anticorpo de teste é pré-adsorvido e aplicado na concentração de saturação a uma superfície sobre a qual um antígeno de KIR3DL2 é imobilizado também pode ser utilizado. A superfície no ensaio de competição simples é preferivelmente um chip BIACORE (ou outros meios adequados para a análise de ressonância de plásmon de superfície). O anticorpo de controle (por exemplo, 10F6) é depois levado em contato com a superfície em uma concentração saturante de KIR3DL2 e o KIR3DL2 e ligação de superfície do anticorpo de controle é medida. Esta ligação do anticorpo de controle é comparada com a ligação do anticorpo de controle à superfície contendo KIR3DL2 na ausência de anticorpo de teste. Em um ensaio de teste, uma redução significante na ligação da superfície contendo KIR3DL2 pelo anticorpo de controle na presença de um anticorpo de teste indica que o anticorpo de teste reconhece substancialmente o mesmo epítopo como o anticorpo de controle tal que o anticorpo de teste “reage cruzado” com o anticorpo de controle. Qualquer anticorpo de teste que reduza a ligação do anticorpo de controle (tal como 10F6) a um antígeno de KIR3DL2 em pelo menos cerca de 30 % ou mais, preferivelmente em torno de 40 %, pode ser considerado ser um anticorpo que se liga substancialmente ao mesmo epítopo ou determinante como um controle (por exemplo, 10F6). Preferivelmente, um tal anticorpo de teste reduzirá a ligação do anticorpo de controle (por exemplo, 10F6) ao antígeno de KIR3DL2 em pelo menos cerca de 50 % (por exemplo, pelo menos cerca de 60 %, pelo menos cerca de 70 %, ou mais). Será avaliado que a ordem dos anticorpos de controle e de teste pode ser invertida: isto é, o anticorpo de controle pode ser primeiro ligado á superfície e o anticorpo de teste é levado em contato com a superfície em seguida em um ensaio de competição. Preferivelmente, o anticorpo tendo afinidade mais alta para o antígeno de KIR3DL2 é ligado á superfície primeiro, como será esperado que a diminuição na ligação observada para o segundo anticorpo (assumindo que os anticorpos sejam reagidos cruzados) será de magnitude maior. Além disso os exemplos de tais ensaios são fornecidos, por exemplo, em Saunal (1995) J. Immunol. Methods 183: 33-41, a divulgação da qual é aqui incorporado por referência.
[00167] Preferivelmente, os anticorpos monoclonais que reconhecem um epítopo de KIR3DL2 reagirão com um epítopo que está presente em uma porcentagem substancial ou ainda todas as células relevantes, por exemplo, células T CD4+ malignas, células de um paciente SS ou MF, mas não reagirão significantemente com outras células, isto é, células que não expressam KIR3DL2. Em um aspecto, os anticorpos anti-KIR3DL2 se ligam a KIR3DL2 mas não se ligam a KIR3DL1 e/ou KIR3DS1.
[00168] Em algumas formas de realização, os anticorpos ligar-se-ão às células que expressam KIR3DL2 de um indivíduo ou indivíduos com uma doença caracterizada pela expressão de células positivas em KIR3DL2, isto é um indivíduo isto é um candidato para o tratamento com um dos métodos aqui descritos usando um anticorpo anti-KIR3DL2. Consequentemente, uma vez que um anticorpo que especificamente reconhece KIR3DL2 nas células é obtido, o mesmo pode ser testado quanto à sua capacidade para ligar-se às células positivas em KIR3DL2 (por exemplo, células T CD4+ malignas) tiradas de um paciente com um distúrbio tal como SS ou MF. Em particular, antes de tratar um paciente com um dos presentes anticorpos, será benéfico testar a capacidade do anticorpo para ligar-se às células malignas tiradas do paciente, por exemplo, em uma amostra de sangue, para maximizar a sua probabilidade de que a terapia será benéfica no paciente.
[00169] Em uma forma de realização, os anticorpos são validados em um imunoensaio para testar a sua capacidade para ligar-se às células que expressam KIR3DL2, por exemplo, células T CD4+ malignas, células CD4+ pró- inflamatórias. Por exemplo, linfócitos de sangue periférico (PBLs) são tirados de uma pluralidade de pacientes, e as células T CD4+ são enriquecidas dos PBLs, por exemplo, pela citometria de fluxo usando anticorpos relevantes (para as células CD4+ malignas ver, por exemplo, Bagot et al. (2001) Blood 97: 13881391, a divulgação da qual é aqui incorporada por referência), ou frações de célula CD4+CD28- são isoladas pela separação magnética em uma coluna MACS (Miltenyi Biotec). A capacidade de um dado anticorpo para ligar-se às células é depois avaliada usando métodos padrão bem conhecidos por aqueles na técnica. Os anticorpos que são descobertos ligar-se a uma proporção substancial (por exemplo, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % ou mais) de células conhecidas expressar KIR3DL2, por exemplo, células T, de uma porcentagem significante de indivíduos ou pacientes (por exemplo, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % ou mais) são adequados para o uso aqui, tanto para propósitos de diagnóstico para determinar a presença ou nível de células T malignas em um paciente ou para o uso nos métodos terapêuticos aqui descritos, por exemplo, para o uso para aumentar ou diminuir o número ou atividade de célula T maligna. Para avaliar a ligação dos anticorpos às células, os anticorpos podem ser direta ou indiretamente rotulados. Quando indiretamente rotulados, um anticorpo secundário, rotulado é tipicamente adicionado. A ligação dos anticorpos às células pode ser depois detectada usando, por exemplo, a análise citofluorométrica (por exemplo, FACScan). Tais métodos são bem conhecidos por aqueles de habilidade na técnica.
[00170] A determinação de se um anticorpo liga-se dentro de uma região de epítopo pode ser realizada em maneiras conhecidas pela pessoa habilitada na técnica. Como um exemplo de tais métodos de mapeamento/caracterização, uma região de epítopo para um anticorpo anti-KIR3DL2 pode ser determinada pela “pegada” de epítopo usando modificação química das aminas/carboxilas expostas na proteína de KIR3DL2. Um exemplo específico de uma tal técnica de pegada é o uso de HXMS (troca de hidrogênio-deutério detectada pela espectrometria de massa) em que uma troca de hidrogênio/deutério de prótons da amida do receptor e proteína ligando, ligação, e retro troca ocorrem, em que os grupos amida da cadeia principal que participam na ligação da proteína são protegidos da retro troca e portanto permanecerão deuterados. As regiões relevantes podem ser identificadas neste ponto pela proteólise péptica, a separação pela cromatografia líquida de alto desempenho de microssondagem rápida, e/ou espectrometria de massa com ionização por eletropulverização. Ver, por exemplo, Ehring H, Analytical Biochemistry, Vol. 267 (2) pp. 252-259 (1999) Engen, J. R. e Smith, D. L. (2001) Anal. Chem. 73, 256A-265A. Um outro exemplo de uma técnica de identificação de epítopo adequada é o mapeamento de epítopo pela ressonância magnética nuclear (RMN), onde tipicamente a posição dos sinais nos espectros de RMN bidimensionais do antígeno livre e do antígeno complexado com o peptídeo de ligação de antígeno, tal como um anticorpo, são comparados. O antígeno tipicamente é de modo seletivo isotopicamente rotulado com 15N de modo que apenas sinais que correspondem ao antígeno e nenhum dos sinais do peptídeo de ligação de antígeno são observados no espectro de RMN. Os sinais de antígeno que se originam dos aminoácidos envolvidos na interação com o peptídeo de ligação de antígeno tipicamente mudarão de posição no espectro do complexo comparado com o espectro do antígeno livre, e os aminoácidos envolvidos na ligação podem ser identificados deste modo. Ver, por exemplo, Ernst Schering Res Found Workshop. 2004; (44): 149-67; Huang et al. Journal of Molecular Biology, Vol. 281 (1) pp. 61-67 (1998); e Saito e Patterson, Methods. Jun de 1996; 9 (3): 51624.
[00171] O mapeamento/caracterização de epítopo também podem ser realizados usando métodos de espectrometria de massa. Ver, por exemplo, Downward, J Mass Spectrom. Abr de 2000; 35 (4): 493-503 e Kiselar e Downard, Anal Chem. 1 de maio de 1999; 71 (9): 1792-801. As técnicas de digestão da protease também podem ser úteis no contexto de mapeamento e identificação de epítopo. As regiões/sequências antigênicas determinantes relevantes podem ser determinadas pela digestão com protease, por exemplo, usando-se tripsina em uma razão de cerca de 1:50 para KIR3DL2 ou digestão durante a noite e no pH 7 a 8, seguido pela análise de espectrometria de massa (MS) para a identificação de peptídeo. Os peptídeos protegidos da clivagem com tripsina pelos ligâmeros anti-KIR3DL2 podem ser subsequentemente identificados pela comparação de amostras individualizadas para a digestão com tripsina e amostras incubadas com anticorpo e depois individualizadas para a digestão por exemplo, pela tripsina (revelando deste modo uma pegada para o ligâmero). Outras enzimas como quimiotripsina, pepsina, etc., também ou alternativamente podem ser usadas em métodos de caracterização de epítopo similares. Além disso, a digestão enzimática pode fornecer um método rápido para analisar se uma sequência determinante antigênica potencial está dentro de uma região do polipeptídeo KIR3DL2 que não está exposta na superfície e, consequentemente, mais provavelmente não relevante em termos de imunogenicidade/antigenicidade. Ver, por exemplo, Manca, Ann Ist Super Sanita. 1991; 27: 15-9 para um debate de técnicas similares.
[00172] A mutagênese loco-dirigida é uma outra técnica útil para a elucidação de um epítopo de ligação. Por exemplo, na “varredura de alanina”, cada resíduo dentro de um segmento de proteína é substituído com um resíduo de alanina, e as consequências para a afinidade de ligação medidas. Se a mutação leva a uma redução significante na afinidade de ligação, está mais provavelmente envolvida na ligação. Os anticorpos monoclonais específicos para epítopos estruturais (isto é, anticorpos que não se ligam à proteína desdobrada) podem ser usados para verificar que a substituição da alanina não influencia a dobra completa da proteína. Ver, por exemplo, Clackson e Wells, Science 1995; 267: 383-386; e Wells, Proc Natl Acad Sci USA 1996; 93: 1-6.
[00173] A microscopia eletrônica também pode ser usada para a “pegada” de epítopo. Por exemplo, Wang et al., Nature 1992; 355: 275-278 usado a aplicação coordenada da microscopia crioeletrônica, reconstrução de imagem tridimensional, e cristalografia de raio X para determinar a pegada física de um fragmento de Fab na superfície do capsídio do vírus mosaico do feijão fradinho nativo.
[00174] Outras formas de ensaio “isento de rótulo” para a avaliação de epítopo incluem ressonância de plásmon de superfície (SPR, BIACORE) e espectroscopia de interferência reflectométrica (RifS). Ver, por exemplo, Fagerstam et al., Journal Of Molecular Recognition 1990; 3: 208-14; Nice et al., J. Chromatogr. 1993; 646: 159-168; Leipert et al., Angew. Chem. Int. Ed. 1998; 37: 3308-3311; Kroger et al., Biosensors and Bioelectronics 2002; 17: 937-944.
[00175] Também deve ser mencionado que em uma ligação de anticorpo o mesmo ou substancialmente o mesmo epítopo como um anticorpo aqui descrito pode ser identificado em um ou mais dos ensaios de competição exemplares aqui descritos.
[00176] Opcionalmente, a captação ou localização celular são avaliadas de modo a selecionar um anticorpo que seja facilmente absorvido dentro da célula e/ou dentro do compartimento celular onde KIR3DL2 está presente. A captação ou localização celulares no geral serão medidas nas células em que o anticorpo é procurado ou acreditado exercer a sua atividade. A captação ou localização celulares podem ser avaliadas pelos métodos padrão, tais como pelo tingimento confocal usando um anticorpo marcado com uma porção detectável (por exemplo, uma porção fluorescente).
[00177] Na imunização e produção de anticorpos em um vertebrado ou célula, etapas de seleção particulares podem ser realizadas para isolar anticorpos como reivindicado. A este respeito, em uma forma de realização específica, são fornecidos métodos de produzir tais anticorpos, compreendendo: (a) imunizar um mamífero não humano com um imunógeno compreendendo um polipeptídeo KIR3DL2; e (b) preparar anticorpos a partir do dito animal imunizado; e (c) selecionar anticorpos da etapa (b) que são capazes de ligar KIR3DL2.
[00178] Tipicamente, um anticorpo anti-KIR3DL2 aqui tem uma afinidade para um polipeptídeo KIR3DL2 na faixa de cerca de 104 a cerca de 1011 M-1 (por exemplo, de cerca de 108 a cerca de 1010 M-1). Por exemplo, um anticorpo pode ter uma constante de dissociação média (Kd) de menos do que 1 x 10-9 M com respeito a KIR3DL2, como determinado, por exemplo, pela triagem pela ressonância de plásmon de superfície (SPR) (tal como pela analise com um dispositivo analítico de SPR da BIAcore®). Em um aspecto exemplar more particular, um anticorpo pode ter uma Kd de cerca de 1 x 10-8 M a cerca de 1 x 10-10 M, ou de cerca de 1 x 10-9 M a cerca de 1 x 10-11 M, para KIR3DL2.
[00179] Os anticorpos podem ser caracterizados por exemplo por um Kd médio de não mais do que cerca de (isto é melhor afinidade do que) 100, 60, 10, 5, ou 1 nanomolar, preferivelmente sub-nanomolar ou opcionalmente não mais do que cerca de 500, 200, 100 ou 10 picomolares. A Kd pode ser determinada por exemplo imobilizando-se proteínas KIR3DL2 humanas recombinantemente produzidas em uma superfície de chip, seguida pela aplicação do anticorpo a ser testado em solução. Em uma forma de realização, o método compreende ainda uma etapa (d), selecionar anticorpos de (b) que são capazes de competir quanto à ligação ao KIR3DL2 com anticorpo 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 ou 20E9.
[00180] Em um aspecto de qualquer uma das formas de realização, os anticorpos preparados de acordo com os presentes métodos são anticorpos monoclonais. Em um outro aspecto, o animal não humano usado para produzir anticorpos de acordo com os métodos da invenção é um mamífero, tal como um roedor, bovino, porcino, galinha, cavalo, coelho, cabra, ou ovelha. Os anticorpos abrangem 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 ou 20E9. Adicionalmente, os anticorpos podem ser opcionalmente especificados como sendo anticorpos outros que não qualquer um dos anticorpos Q241 e Q66 (Pende, et al. (1996) J Exp Med 184:505518), clone 5,133 (Miltenyi Biotec), “AZ158” (Parolini, S., et al. (2002) In Leucocyte typing VII. D. Mason, editor. Oxford University Press, Oxford. 415-417 e WO2010/081890 (por exemplo, anticorpos tendo a região variável de cadeia pesada e leve das SEQ ID NOS: 8 e 10 da WO2010/081890), ou derivados dos precedentes, por exemplo, que compreendem a região de ligação de antígeno no todo ou em parte.
[00181] De acordo com uma forma de realização alternativa, o DNA que codifica um anticorpo que liga um epítopo presente nos polipeptídeos de KIR3DL2 é isolado do hibridoma e colocado em um vetor de expressão apropriado para transfecção em um hospedeiro apropriado. O hospedeiro é depois usado para a produção recombinante do anticorpo, ou variantes dos mesmos, tais como uma versão humanizada deste anticorpo monoclonal, fragmentos ativos do anticorpo, anticorpos quiméricos compreendendo a porção de reconhecimento de antígeno do anticorpo, ou versões compreendendo uma porção detectável.
[00182] O DNA que codifica os anticorpos monoclonais, por exemplo, anticorpos 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 ou 20E9, pode ser facilmente isolado e sequenciado usando procedimentos convencionais (por exemplo, usando-se sondas de oligonucleotídeo que são capazes de ligação especificamente aos genes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos de murino). Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são depois transfectados em células hospedeiras tais como células de E. coli, células COS símias, células do ovário do hamster chinês (CHO), ou células de mieloma que de outro modo não produzem proteína de imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Como descrito em outro lugar no presente relatório descritivo, tais sequências de DNA podem ser modificadas para qualquer um de um grande número de propósitos, por exemplo, para humanizar anticorpos, produzir fragmentos ou derivados, ou para modificar a sequência do anticorpo, por exemplo, no sítio de ligação de antígeno de modo a otimizar a especificidade de ligação do anticorpo.
[00183] A expressão recombinante nas bactérias de DNA que codificam o anticorpo é bem conhecida na técnica (ver, por exemplo, Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol., 5, pp. 256 (1993); e Pluckthun, Immunol. 130, p. 151 (1992).
Atividade de avaliação
[00184] Uma vez que um composto de ligação ao antígeno é obtido ele geralmente será avaliado quanto à sua capacidade de incorporar em células alvos que expressam KIR3DL2 ou causar incorporação de KIR3DL2 em células alvos que expressam KIR3DL2 para induzir ADCC ou CDC para, inibir a atividade pró-inflamatória e/ou proliferação de e/ou causar a eliminação de células alvos que expressam KIR3DL2. Avaliar a capacidade do composto de ligação ao antígeno de incorporar ou induzir ADCC, CDC ou geralmente levar à eliminação ou inibição da atividade de células alvos que expressam KIR3DL2, pode ser realizado em qualquer estágio adequado do método, por exemplo, como nos exemplos são fornecidos aqui. Esta avaliação pode ser útil em uma ou mais das várias etapas envolvidas na identificação, produção e/ou desenvolvimento de um anticorpo (ou outro composto) destinado para uso terapêutico. Por exemplo, a atividade pode ser avaliada no contexto de um método de triagem para identificar compostos de ligação ao antígeno candidatos, ou em métodos onde um composto de ligação ao antígeno é selecionado e feito adequado ao ser humano (por exemplo, feito quimérico ou humanizado no caso de um anticorpo), onde uma célula que expressa o composto de ligação ao antígeno (por exemplo, uma célula hospedeira que expressa um composto de ligação ao antígeno recombinante) foi obtida e é avaliada quanto à sua capacidade de produzir anticorpos funcionais (ou outros compostos), e/ou onde uma quantidade de composto de ligação ao antígeno foi produzida e deve ser avaliada quanto à atividade (por exemplo, para testar porções ou lotes de produto). Geralmente o composto de ligação ao antígeno será conhecido para especificamente ligar-se a um polipeptídeo KIR3DL2. A etapa pode envolver testar uma pluralidade (por exemplo, um número muito grande usando métodos de triagem de rendimento alto ou um número menor) de compostos de ligação ao antígeno.
[00185] Como usado aqui, um anticorpo anti-KIR3DL2 que não é “incorporado” ou que não “incorpora” é um que não é substancialmente absorvido por (isto é, entra) na célula em ligação a KIR3DL2 em uma célula mamífera (isto é, KIR3DL2 da superfície celular). O anticorpo não de incorporação naturalmente incluirá fragmentos de anticorpo, anticorpo humano ou humanizado e conjugado de anticorpo.
[00186] Se um anticorpo anti-KIR3DL2 incorpora em ligar KIR3DL2 em uma célula mamífera, ou se um polipeptídeo KIR3DL2 passa por incorporação intracelular (por exemplo, em ser ligado por um anticorpo) pode ser determinado por vários ensaios incluindo aqueles descritos nos exemplos experimentais aqui. Por exemplo, para testar a incorporação in vivo, o anticorpo de teste é rotulado e introduzido em um animal conhecido como tendo KIR3DL2 expressado na superfície de certas células. O anticorpo pode ser radiorrotulado ou rotulado com partículas fluorescentes ou douradas, por exemplo. Animais adequados para este ensaio incluem um mamífero tal como um camundongo nu que contém um transplante de tumor ou xenoenxerto que expressam KIR3DL2 humano, ou um camundongo em que células transfectadas com KIR3DL2 humano foram introduzidas, ou um camundongo transgênico que expressa o transgene de KIR3DL2. Controles apropriados incluem animais que não receberam o anticorpo de teste ou que receberam um anticorpo não relacionado, e animais que receberam um anticorpo para um outro antígeno nas células de interesse, anticorpo este que é conhecido como sendo incorporado na ligação ao antígeno. O anticorpo pode ser administrado ao animal, por exemplo, por injeção intravenosa. Em intervalos de tempo adequados, seções de tecido do animal podem ser preparadas usando métodos conhecidos ou como descrito nos exemplos experimentais abaixo, e analisadas por microscopia óptica ou microscopia eletrônica, para incorporação assim como a localização do anticorpo incorporado na célula. Para incorporação in vitro, as células podem ser incubadas em placas de cultura de tecido na presença ou ausência dos anticorpos relevantes adicionados aos meios de cultura e processadas para análise microscópica em pontos no tempo desejados. A presença de um anticorpo rotulado, incorporado nas células pode ser diretamente visualizada por microscopia ou por autorradiografia se o anticorpo radiorrotulado for usado. Opcionalmente, em microscopia, a co-localização com um polipeptídeo conhecido ou outro componente celular pode ser avaliada; por exemplo, a co- localização com o marcador endossômico/lisossômico LAMP-1 (CD107a) pode fornecer informação sobre a localização subcelular do anticorpo incorporado. Alternativamente, em um ensaio bioquímico quantitativo, uma população de células que compreendem células que expressam KIR3DL2 é contatada in vitro ou in vivo com um anticorpo de teste radiorrotulado e as células (se contatadas in vivo, as células depois são isoladas depois de uma quantidade de tempo adequada) são tratadas com uma protease ou submetidas a uma lavagem com ácido para remover o anticorpo não incorporado na superfície celular. As células são trituradas e a quantidade de contagens por minuto (cpm) radioativas, resistentes à protease associadas com cada porção de células é medida passando-se o homogenado através de um contador de cintilação. Com base na atividade específica conhecido do anticorpo radiorrotulado, o número de moléculas de anticorpo incorporadas por célula pode ser deduzido das contagens de cintilação das células trituradas. As células são “contatadas” com o anticorpo in vitro preferivelmente na forma de solução tal como adicionando-se as células aos meios de cultura celular na placa ou frasco de cultura e misturando-se o anticorpo apropriadamente com os meios para garantir exposição uniforme das células ao anticorpo.
[00187] O teste de CDC e ADCC pode ser realizado e pode ser determinado por vários ensaios incluindo aqueles descritos nos exemplos experimentais aqui (ver os Exemplos 4 e 5). O teste de ADCC tipicamente envolve avaliar a citotoxicidade mediada por célula em que uma célula alvo que expressa KIR3DL2 (por exemplo, uma célula Cou-L, célula da Síndrome de Sezary ou outra célula que expressa KIR3DL2) com anticorpo anti-KIR3DL2 ligado é reconhecida por uma célula efetora que porta receptores Fc, sem o envolvimento do complemento. Uma célula que não expressa um antígeno de KIR3DL2 pode opcionalmente ser usada como um controle. A ativação de citotoxicidade de célula NK é avaliada medindo-se um aumento na produção de citocina (por exemplo, produção de IFN-) ou marcadores de citotoxicidade (por exemplo, mobilização de CD107). Preferivelmente o anticorpo induzirá um aumento na produção de citocina, expressão de marcadores de citotoxicidade, ou lise de célula alvo de pelo menos 20 %, 50 %, 80 %, 100 %, 200 % ou 500 % na presença de células alvos, comparado a um anticorpo de controle (por exemplo, um anticorpo que não liga-se a KIR3DL2, um anticorpo de KIR3DL2 tendo regiões constantes de murino). Em exemplos adicionais, a lise de células alvos é detectada, por exemplo, em um ensaio de liberação de cromo, preferivelmente o anticorpo induzirá a lise de pelo menos 10 %, 20 %, 30 %, 40 % ou 50 % das células alvos. Onde um composto de ligação ao antígeno é testado quanto à sua capacidade de (a) induzir tanto ADCC quanto (b) incorporar em células que expressam KIR3DL2 e/ou induzir a incorporação de KIR3DL2, os ensaios de (a) e (b) podem ser realizados em qualquer ordem. Entretanto, maior a extensão e velocidade de incorporação geralmente será esperada estar associada com uma diminuição da extensão da atividade de CDC e ADCC.
Anticorpo 10F6
[00188] A sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada do anticorpo 10F6 é listada como SEQ ID NO: 2, a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve é listada como SEQ ID NO: 3. Em uma forma de realização específica, fornecido é um anticorpo que liga essencialmente o mesmo epítopo ou determinante como anticorpos monoclonais 10F6; opcionalmente o anticorpo compreende uma região de ligação ao antígeno de anticorpo 10F6. Em qualquer uma das formas de realização aqui, o anticorpo 10F6 pode ser caracterizado por sua sequência de aminoácido e/ou sequência de ácido nucleico que o codificam. Em uma forma de realização, o anticorpo monoclonal compreende a porção Fab ou F(ab’)2 de 10F6. Também fornecido é um anticorpo monoclonal que compreende a região variável de cadeia pesada de 10F6. De acordo com uma forma de realização, o anticorpo monoclonal compreende as três CDRs da região variável de cadeia pesada de 10F6. Também fornecido é um anticorpo monoclonal que compreende ainda a região variável de cadeia leve variável de 10F6 ou uma, duas ou três das CDRs da região variável de cadeia leve de 10F6. Opcionalmente qualquer uma ou mais das ditas CDRs de cadeias leves ou pesadas podem conter uma, duas, três, quatro ou cinco ou mais modificações de aminoácido (por exemplo, substituições, inserções ou supressões). Opcionalmente, fornecido é um anticorpo onde qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve e/ou pesada que compreende parte ou toda uma região de ligação ao antígeno de anticorpo 10F6 são fundidas a uma região constante de imunoglobulina do tipo de IgG humana, opcionalmente uma região constante humana, opcionalmente um isótipo de IgG1 ou IgG3 humano.
[00189] Em um outro aspecto, fornecido é um polipeptídeo purificado que codifica um anticorpo, em que o anticorpo compreende: uma região HCDR1 que compreende uma sequência de aminoácido GYTFTIAGMQ como apresentado na SEQ ID NO: 6, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma (por exemplo, IAGMQ (SEQ ID NO: 4), GYTFTI (SEQ ID NO: 5)), em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR2 que compreende uma sequência de aminoácido WINTHSGVPKYAEDFKG como apresentado na SEQ ID NO: 7, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma (por exemplo, WINTHSGVPK (SEQ ID NO: 8)), em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR3 que compreende uma sequência de aminoácido GGDEGVMDY como apresentado na SEQ ID NO: 9, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR1 que compreende uma sequência de aminoácido KASQDVSTAVA como apresentado na SEQ ID NO: 10, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR2 que compreende uma sequência de aminoácido WASTRHT como apresentado na SEQ ID NO: 11, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR3 que compreende uma sequência de aminoácido QQHYNTPWT como apresentado na SEQ ID NO: 12, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser suprimidos ou substituídos por um aminoácido diferente.
[00190] Em um outro aspecto, fornecido é um anticorpo que liga KIR3DL2 humano, que compreende: (a) a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (b) a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 3, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (c) a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 3, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (d) as sequências de aminoácido de cadeia pesada CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como mostrado nas SEQ ID NOS: 4 a 6, 7 a 8 e 9, respectivamente, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (e) as sequências de aminoácido de cadeia leve CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como mostrado nas SEQ ID NOS: 10, 11 e 12, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (f) as sequências de aminoácido de cadeia pesada CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como mostrado nas SEQ ID NOS: 4, 7 e 9, respectivamente, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e as sequências de aminoácido de cadeia leve CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como mostrado nas SEQ ID NOS: 10, 11 e 12, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente. (g) Em um outro aspecto de qualquer uma das formas de realização aqui, qualquer uma das CDRs 1, 2 e 3 das cadeias pesadas e leves pode ser caracterizada por uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, e/ou como tendo uma sequência de aminoácido que compartilha pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % de identidade de sequência com a CDR particular ou conjunto de CDRs listadas na SEQ ID NO correspondente.
[00191] Em um outro aspecto, fornecido é um anticorpo que compete quanto à LIGAÇÃO KIR3DL2 com um anticorpo monoclonal de (a) a (f), acima.
Anticorpo 2B12
[00192] A sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada do anticorpo 2B12 é listada na SEQ ID NO: 13, a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve é listada como SEQ ID NO: 14. Em uma forma de realização, fornecido é um anticorpo que liga essencialmente o mesmo epítopo ou determinante como anticorpos monoclonais 2B12; opcionalmente o anticorpo compreende uma região de ligação ao antígeno do anticorpo 2B12. Em qualquer uma das formas de realização aqui, o anticorpo 2B12 pode ser caracterizado por sua sequência de aminoácido e/ou sequência de ácido nucleico que o codificam. Em uma forma de realização, o anticorpo monoclonal compreende a porção Fab ou F(ab’)2 de 2B12. Também fornecido é um anticorpo monoclonal que compreende a região variável de cadeia pesada de 2B12. De acordo com uma forma de realização, o anticorpo monoclonal compreende as três CDRs da região variável de cadeia pesada de 2B12. Também fornecido é um anticorpo monoclonal que compreende ainda a região variável de cadeia leve variável de 2B12 ou uma, duas ou três das CDRs da região variável de cadeia leve de 2B12. Opcionalmente qualquer uma ou mais das ditas CDRs de cadeias leves ou pesadas podem conter uma, duas, três, quatro ou cinco modificações de aminoácido (por exemplo, substituições, inserções ou supressões). Opcionalmente, fornecido é um anticorpo onde qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve e/ou pesada que compreende parte ou toda uma região de ligação ao antígeno do anticorpo 2B12 são fundidas a uma região constante de imunoglobulina do tipo IgG, opcionalmente uma região constante humana, opcionalmente um isótipo de IgG1 ou IgG4.
[00193] Em um outro aspecto, fornecido é um polipeptídeo purificado que codifica um anticorpo, em que o anticorpo compreende: uma região HCDR1 que compreende uma sequência de aminoácido GYTFTTAGMQ como apresentado na SEQ ID NO: 17, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma (por exemplo, TAGMQ (SEQ ID NO: 15), GYTFTT (SEQ ID NO: 16)), em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR2 que compreende uma sequência de aminoácido WINSHSGVPKYAEDFK como apresentado na SEQ ID NO: 18, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma (por exemplo, WINSHSGVP (SEQ ID NO: 19)), em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR3 que compreende uma sequência de aminoácido GGDEGVMDYW como apresentado na SEQ ID NO: 20, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR1 que compreende uma sequência de aminoácido KASQDVSTAVA como apresentado na SEQ ID NO: 10, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR2 que compreende uma sequência de aminoácido WTSTRHT como apresentado na SEQ ID NO: 21, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou uma região LCDR3 que compreende uma sequência de aminoácido QQHYSTPWT como apresentado na SEQ ID NO: 22, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser suprimidos ou substituídos por um aminoácido diferente, ou onde a sequência pode compreender uma inserção de um ou mais aminoácidos.
[00194] Em um outro aspecto, fornecido é um anticorpo que liga KIR3DL2 humano, que compreende: (a) a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 13, opcionalmente em que um, dois, três ou mais dos resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (b) a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 14, opcionalmente em que um, dois, três ou mais dos resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (c) a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 13, opcionalmente em que um, dois, três ou mais dos resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 14, opcionalmente em que um ou mais dos resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (d) as sequências de aminoácido de cadeia pesada CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como mostrado nas SEQ ID NOS: 15 a 17, 18 a 19 e 20, respectivamente, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (e) as sequências de aminoácido de cadeia leve CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como mostrado nas SEQ ID NOS: 10, 21 e 22, respectivamente, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (f) as sequências de aminoácido de cadeia pesada CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como mostrado nas SEQ ID NOS: 15, 18 e 20, respectivamente, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e as sequências de aminoácido de cadeia leve CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como mostrado nas SEQ ID NOS: 10, 21 e 22, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente.
[00195] Em um outro aspecto de qualquer uma das formas de realização aqui, qualquer uma das CDRs 1, 2 e 3 das cadeias pesadas e leves pode ser caracterizada por uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, e/ou como tendo uma sequência de aminoácido que compartilha pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % de identidade de sequência com a CDR particular ou conjunto de CDRs listadas na SEQ ID NO correspondente.
[00196] Em um outro aspecto, fornecido é um anticorpo que compete quanto à LIGAÇÃO KIR3DL2 com um anticorpo monoclonal de (a) a (f), acima.
Anticorpo 10G5
[00197] A sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada do anticorpo 10G5 é listada como SEQ ID NO: 23, a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve é listada como SEQ ID NO: 24. Em uma forma de realização específica, fornecido é um anticorpo que liga essencialmente o mesmo epítopo ou determinante como anticorpos monoclonais 10G5; opcionalmente o anticorpo compreende uma região de ligação ao antígeno do anticorpo 10G5. Em qualquer uma das formas de realização aqui, o anticorpo 10G5 pode ser caracterizado por sua sequência de aminoácido e/ou sequência de ácido nucleico que o codificam. Em uma forma de realização, o anticorpo monoclonal compreende a porção Fab ou F(ab’)2 de 10G5. Também fornecido é um anticorpo monoclonal que compreende a região variável de cadeia pesada de 10G5. De acordo com uma forma de realização, o anticorpo monoclonal compreende as três CDRs da região variável de cadeia pesada de 10G5. Também fornecido é um anticorpo monoclonal que compreende ainda a região variável de cadeia leve variável de 10G5 ou uma, duas ou três das CDRs da região variável de cadeia leve de 10G5. Opcionalmente qualquer uma ou mais das ditas CDRs de cadeias leves ou pesadas podem conter uma, duas, três, quatro ou cinco ou mais modificações de aminoácido (por exemplo, substituições, inserções ou supressões). Opcionalmente, fornecido é um anticorpo onde qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve e/ou pesada que compreende parte ou toda uma região de ligação ao antígeno do anticorpo 10G5 são fundidas a uma região constante de imunoglobulina do tipo IgG humana, opcionalmente uma região constante humana, opcionalmente um isótipo de IgG1 ou IgG3 humano.
[00198] Em um outro aspecto, fornecido é um polipeptídeo purificado que codifica um anticorpo, em que o anticorpo compreende: uma região HCDR1 que compreende uma sequência de aminoácido GYTFTSYTMH como apresentado na SEQ ID NO: 27, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma (por exemplo, SYTMH (SEQ ID NO: 25), GYTFTS (SEQ ID NO: 26)), em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR2 que compreende uma sequência de aminoácido YINPSSGYTENNRKF como apresentado na SEQ ID NO: 28, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma (por exemplo, YINPSSGY (SEQ ID NO : 29)), em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR3 que compreende uma sequência de aminoácido RLGKGLLPPFDY como apresentado na SEQ ID NO: 30, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR1 que compreende uma sequência de aminoácido RASENIYSNLA como apresentado na SEQ ID NO: 31, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR2 que compreende uma sequência de aminoácido AATNLAD como apresentado na SEQ ID NO: 32, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR3 que compreende uma sequência de aminoácido QHFWGTPYT como apresentado na SEQ ID NO: 33, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser suprimidos ou substituídos por um aminoácido diferente.
[00199] Em um outro aspecto, fornecido é um anticorpo que liga KIR3DL2 humano, que compreende: (a) a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 23, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (b) a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 24, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (c) a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 23, opcionalmente em que um ou mais resíduos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 24 em que um, dois, três ou mais resíduos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (d) as sequências de aminoácido de cadeia pesada CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como mostrado na SEQ ID NO: 25 a 27, 28 a 29 e 30, respectivamente, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (e) as sequências de aminoácido de cadeia leve CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como mostrado nas SEQ ID NOS: 31, 32, e 33, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (f) as sequências de aminoácido de cadeia pesada CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como mostrado nas SEQ ID NOS: 25, 28 e 30, respectivamente, opcionalmente em que um ou mais resíduos de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e as sequências de aminoácido de cadeia leve CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como mostrado nas SEQ ID NOS: 31, 32, e 33, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente.
[00200] Em um outro aspecto de qualquer uma das formas de realização aqui, qualquer uma das CDRs 1, 2 e 3 das cadeias pesadas e leves pode ser caracterizada por uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, e/ou como tendo uma sequência de aminoácido que compartilha pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % de identidade de sequência com a CDR particular ou conjunto de CDRs listadas na SEQ ID NO correspondente.
[00201] Em um outro aspecto, fornecido é um anticorpo que compete quanto à LIGAÇÃO KIR3DL2 com um anticorpo monoclonal de (a) a (f), acima.
Anticorpo 13H1
[00202] A sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada do anticorpo 13H1 é listada como SEQ ID NO: 34, a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve é listada como SEQ ID NO: 35. Em uma forma de realização específica, fornecido é um anticorpo que liga essencialmente o mesmo epítopo ou determinante como anticorpos monoclonais 13H1; opcionalmente o anticorpo compreende uma região de ligação ao antígeno do anticorpo 13H1. Em qualquer uma das formas de realização aqui, o anticorpo 13H1 pode ser caracterizado por sua sequência de aminoácido e/ou sequência de ácido nucleico que o codificam. Em uma forma de realização, o anticorpo monoclonal compreende a porção Fab ou F(ab’)2 de 13H1. Também fornecido é um anticorpo monoclonal que compreende a região variável de cadeia pesada de 13H1. De acordo com uma forma de realização, o anticorpo monoclonal compreende as três CDRs da região variável de cadeia pesada de 13H1. Também fornecido é um anticorpo monoclonal que compreende ainda a região variável de cadeia leve variável de 13H1 ou uma, duas ou três das CDRs da região variável de cadeia leve de 13H1. Opcionalmente qualquer uma ou mais das ditas CDRs de cadeias leves ou pesadas podem conter uma, duas, três, quatro ou cinco ou mais modificações de aminoácido (por exemplo, substituições, inserções ou supressões). Opcionalmente, fornecido é um anticorpo onde qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve e/ou pesada que compreende parte ou toda uma região de ligação ao antígeno do anticorpo 13H1 são fundidas a uma região constante de imunoglobulina do tipo IgG humana, opcionalmente uma região constante humana, opcionalmente um isótipo de IgG1 ou IgG3 humano.
[00203] Em um outro aspecto, fornecido é um polipeptídeo purificado que codifica um anticorpo, em que o anticorpo compreende: uma região HCDR1 que compreende uma sequência de aminoácido HYSFIGYTM como apresentado na SEQ ID NO: 38, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma (por exemplo, GYTMN (SEQ ID NO: 36), HYSFIG (SEQ ID NO: 37)), em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR2 que compreende uma sequência de aminoácido LINPYNGDTTYNQKFKG como apresentado na SEQ ID NO: 39, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma (por exemplo, LINPYNGDTT (SEQ ID NO: 40)), em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR3 que compreende uma sequência de aminoácido ENWGYPYAMDY como apresentado na SEQ ID NO: 41, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR1 que compreende uma sequência de aminoácido RASESVDNFGISFMN como apresentado na SEQ ID NO: 42, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR2 que compreende uma sequência de aminoácido AASNQGS como apresentado na SEQ ID NO: 43, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR3 que compreende uma sequência de aminoácido QQSKEVPYT como apresentado na SEQ ID NO: 44, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser suprimidos ou substituídos por um aminoácido diferente.
[00204] Em um outro aspecto, fornecido é um anticorpo que liga KIR3DL2 humano, que compreende: (a) a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 34, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (b) a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 35, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (c) a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 34, opcionalmente em que um ou mais resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 35, em que um, dois, três ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (d) as sequências de aminoácido de cadeia pesada CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como mostrado nas SEQ ID NOS: 36 a 38, 39 a 40 e 41, respectivamente, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácido de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (e) as sequências de aminoácido de cadeia leve CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como mostrado nas SEQ ID NOS: 42, 43 e 44, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácido de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (f) as sequências de aminoácido de cadeia pesada CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como mostrado nas SEQ ID NOS: 36, 39 e 41, respectivamente, opcionalmente em que um ou mais resíduos de aminoácido de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e as sequências de aminoácido de cadeia leve CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como mostrado nas SEQ ID NOS: 42, 43 e 44, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácido de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente.
[00205] Em um outro aspecto de qualquer uma das formas de realização aqui, qualquer uma das CDRs 1, 2 e 3 das cadeias pesadas e leves pode ser caracterizada por uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, e/ou como tendo uma sequência de aminoácido que compartilha pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % de identidade de sequência com a CDR particular ou conjunto de CDRs listadas na SEQ ID NO correspondente.
[00206] Em um outro aspecto, fornecido é um anticorpo que compete quanto à LIGAÇÃO KIR3DL2 com um anticorpo monoclonal de (a) a (f), acima. Anticorpo 1E2 (a) A sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada do anticorpo 1E2 é listada como SEQ ID NO: 45, a sequência de aminoácido da região variável de cadeia leve é listada como SEQ ID NO: 46. Em uma forma de realização específica, fornecido é um anticorpo que liga essencialmente o mesmo epítopo ou determinante como anticorpos monoclonais 1E2; opcionalmente o anticorpo compreende uma região de ligação ao antígeno do anticorpo 1E2. Em qualquer uma das formas de realização aqui, o anticorpo 1E2 pode ser caracterizado por sua sequência de aminoácido e/ou sequência de ácido nucleico que o codificam. Em uma forma de realização, o anticorpo monoclonal compreende a porção Fab ou F(ab’)2 de 1E2. Também fornecido é um anticorpo monoclonal que compreende a região variável de cadeia pesada de 1E2. De acordo com uma forma de realização, o anticorpo monoclonal compreende as três CDRs da região variável de cadeia pesada de 1E2. Também fornecido é um anticorpo monoclonal que compreende ainda a região variável de cadeia leve variável de 1E2 ou uma, duas ou três das CDRs da região variável de cadeia leve de 1E2. Opcionalmente qualquer uma ou mais das ditas CDRs de cadeias leves ou pesadas podem conter uma, duas, três, quatro ou cinco ou mais modificações de aminoácido (por exemplo, substituições, inserções ou supressões). Opcionalmente, fornecido é um anticorpo onde qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve e/ou pesada que compreende parte ou toda uma região de ligação ao antígeno do anticorpo 1E2 são fundidas a uma região constante de imunoglobulina do tipo IgG humana, opcionalmente uma região constante humana, opcionalmente um isótipo de IgG1 ou IgG3 humano.
[00207] Em um outro aspecto, fornecido é um polipeptídeo purificado que codifica um anticorpo, em que o anticorpo compreende: uma região HCDR1 que compreende uma sequência de aminoácido GYTFTDYAMN como apresentado na SEQ ID NO: 49, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma (por exemplo, DYAMN (SEQ ID NO: 47), GYTFTD (SEQ ID NO: 48)), em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR2 que compreende uma sequência de aminoácido VISTYYGDANYNQKFKG como apresentado na SEQ ID NO: 50, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma (por exemplo, VISTYYGDAN (SEQ ID NO: 51)), em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR3 que compreende uma sequência de aminoácido IYYDYDGSY como apresentado na SEQ ID NO: 52, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR1 que compreende uma sequência de aminoácido RSSQSLVHSNGNTYLH como apresentado na SEQ ID NO: 53, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR2 que compreende uma sequência de aminoácido KVSNRFS como apresentado na SEQ ID NO: 54, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR3 que compreende uma sequência de aminoácido SQSTHVPPYT como apresentado na SEQ ID NO: 55, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser suprimidos ou substituídos por um aminoácido diferente.
[00208] Em um outro aspecto, fornecido é um anticorpo que liga KIR3DL2 humano, que compreende: (a) a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 42, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (b) a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 43, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (c) a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 42, opcionalmente em que um ou mais resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e a região variável de cadeia leve da SEQ ID NO: 43, opcionalmente em que um, dois, três ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (d) as sequências de aminoácido de cadeia pesada CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como mostrado nas SEQ ID NOS: 47 a 49, 50 a 51 e 52, respectivamente, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácido de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (e) as sequências de aminoácido de cadeia leve CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como mostrado nas SEQ ID NOS: 53, 54 e 55, opcionalmente em que um, dois, três resíduos de aminoácido de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (f) as sequências de aminoácido de cadeia pesada CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como mostrado nas SEQ ID NOS: 47, 50 e 52, opcionalmente em que um ou mais resíduos de aminoácido de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e as sequências de aminoácido de cadeia leve CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como mostrado nas SEQ ID NOS: 53, 54 e 55, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácido de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente.
[00209] Em um outro aspecto de qualquer uma das formas de realização aqui, qualquer uma das CDRs 1, 2 e 3 das cadeias pesadas e leves pode ser caracterizada por uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, e/ou como tendo uma sequência de aminoácido que compartilha pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % de identidade de sequência com a CDR particular ou conjunto de CDRs listadas na SEQ ID NO correspondente.
[00210] Em um outro aspecto, fornecido é um anticorpo que compete quanto à LIGAÇÃO KIR3DL2 com um anticorpo monoclonal de (a) a (f), acima.
Anticorpo 9E10
[00211] A sequência de aminoácido da região variável de cadeia pesada de 9E10 é listada como SEQ ID NO: 56, a sequência de aminoácido das regiões variáveis de cadeia leve (duas cadeias leves alternativas disponíveis) de 9E10 são listadas como SEQ ID NOS: 57 e 67. Em uma forma de realização específica, fornecido é um anticorpo que liga essencialmente o mesmo epítopo ou determinante como anticorpos monoclonais 9E10; opcionalmente o anticorpo compreende uma região de ligação ao antígeno do anticorpo 9E10. Em qualquer uma das formas de realização aqui, o anticorpo 9E10 pode ser caracterizado por sua sequência de aminoácido e/ou sequência de ácido nucleico que o codificam. Em uma forma de realização, o anticorpo monoclonal compreende a porção Fab ou F(ab’)2 de 9E10. Também fornecido é um anticorpo monoclonal que compreende a região variável de cadeia pesada de 9E10. De acordo com uma forma de realização, o anticorpo monoclonal compreende as três CDRs da região variável de cadeia pesada de 9E10. Também fornecido é um anticorpo monoclonal que compreende ainda a região variável de cadeia leve variável de 9E10 ou uma, duas ou três das CDRs da região variável de cadeia leve de 9E10. Opcionalmente qualquer uma ou mais das ditas CDRs de cadeias leves ou pesadas podem conter uma, duas, três, quatro ou cinco modificações de aminoácido (por exemplo, substituições, inserções ou supressões). Opcionalmente, fornecido é um anticorpo onde qualquer uma das regiões variáveis de cadeia leve e/ou pesada que compreende parte ou toda uma região de ligação ao antígeno do anticorpo 9E10 são fundidas a uma região constante de imunoglobulina do tipo IgG, opcionalmente uma região constante humana, opcionalmente um isótipo de IgG1 ou IgG4 humano.
[00212] Em um outro aspecto, fornecido é um polipeptídeo purificado que codifica um anticorpo, em que o anticorpo compreende: uma região HCDR1 que compreende uma sequência de aminoácido GYTFTSYTMH como apresentado na SEQ ID NO: 60, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma (por exemplo, SYTMH (SEQ ID NO: 58), GYTFTS (SEQ ID NO: 59)), em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR2 que compreende uma sequência de aminoácido YINPSSGYTDYNQKFKD como apresentado na SEQ ID NO: 61, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma (por exemplo, YINPSSGYTD (SEQ ID NO: 62)), em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região HCDR3 que compreende uma sequência de aminoácido LGKGLLPPFDY como apresentado na SEQ ID NO: 63, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR1 que compreende uma sequência de aminoácido KSNQNLLWSGNQRYCLV como apresentado na SEQ ID NO: 64, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR2 que compreende uma sequência de aminoácido WTSDRYS como apresentado na SEQ ID NO: 65, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente; uma região LCDR3 que compreende uma sequência de aminoácido QQHLHIPYT como apresentado na SEQ ID NO: 66, ou uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, em que um ou mais destes aminoácidos podem ser suprimidos ou substituídos por um aminoácido diferente, ou onde a sequência pode compreender uma inserção de um ou mais aminoácidos.
[00213] Em um outro aspecto, fornecido é um anticorpo que liga KIR3DL2 humano, que compreende: (a) a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 56, opcionalmente em que um, dois, três resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (b) a região variável de cadeia leve das SEQ ID NOS: 57 ou 67, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (c) a região variável de cadeia pesada da SEQ ID NO: 56, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e a região variável de cadeia leve das SEQ ID NOS: 57 ou 67, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (d) as sequências de aminoácido de cadeia pesada CDR 1 e 2 (HCDR1, HCDR2) como mostrado nas SEQ ID NOS: 58, 59 ou 60, 61 a 62 e 63, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (e) as sequências de aminoácido de cadeia leve CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como mostrado nas SEQ ID NOS: 64, 65 e 66, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e/ou (f) as sequências de aminoácido de cadeia pesada CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) como mostrado nas SEQ ID NOS: 58, 61 e 63, opcionalmente em que um, dois, três resíduos de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente; e as sequências de aminoácido de cadeia leve CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) como mostrado nas SEQ ID NOS: 64, 65 e 66, opcionalmente em que um, dois, três ou mais resíduos de qualquer CDR podem ser substituídos por um aminoácido diferente.
[00214] Em uma outra forma de realização, fornecido é anticorpo 1C3 (anti- domínio D2), sua região variável e CDRs. Em uma forma de realização, fornecido é um anticorpo tendo respectivamente uma região VH e VL das SEQ ID NOS: 170 e 171 (1C3). Em uma forma de realização, fornecido é um anticorpo tendo uma cadeia pesada que compreende as CDRs 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que compreendem uma sequência da SEQ ID NO: 172, 173 ou 174 (HCDR1), SEQ ID NO: 175 ou 176 (HCDR2) e SEQ ID NO: 177 (HCDR3) respectivamente, em que cada CDR pode opcionalmente compreender 1, 2, 3 ou 4 substituições, supressões ou inserções de aminoácido. Em uma forma de realização, fornecido é um anticorpo tendo (i) uma cadeia pesada que compreende as CDRs 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que compreendem uma sequência da SEQ ID NO: 172, 173 ou 174 (HCDR1), SEQ ID NO: 175 ou 176 (HCDR2) e SEQ ID NO: 177 (HCDR3) respectivamente, e (ii) uma cadeia leve que compreende a CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que compreendem uma sequência da SEQ ID NO: 178, 179 ou 180, respectivamente, em que cada CDR pode opcionalmente compreender 1, 2, 3 ou 4 substituições, supressões ou inserções de aminoácido.
[00215] Em uma outra forma de realização, fornecido é o anticorpo 20E9 (anti- domínio D2), sua região variável e CDRs. Em uma forma de realização, fornecido é um anticorpo tendo respectivamente uma região VH e VL das SEQ ID NOS: 181 e 182 (20E9). Em uma forma de realização, fornecido é um anticorpo tendo uma cadeia pesada que compreende as CDRs 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que compreendem uma sequência da SEQ ID NO: 183, 184 ou 185 (HCDR1), SEQ ID NO: 186 ou 187 (HCDR2) e SEQ ID NO: 188 (HCDR3) respectivamente, em que cada CDR pode opcionalmente compreender 1, 2, 3 ou 4 substituições, supressões ou inserções de aminoácido. Em uma forma de realização, fornecido é um anticorpo tendo (i) uma cadeia pesada que compreende as CDRs 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que compreendem uma sequência da SEQ ID NO: 183, 184 ou 185 (HCDR1), SEQ ID NO: 186 ou 187 (HCDR2) e SEQ ID NO: 188 (HCDR3) respectivamente, e (ii) uma cadeia leve que compreende a CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que compreendem uma sequência da SEQ ID NO: 189, 190 ou 191, respectivamente, em que cada CDR pode opcionalmente compreender 1, 2, 3 ou 4 substituições, supressões ou inserções de aminoácido.
[00216] Em um outro aspecto de qualquer uma das formas de realização aqui, qualquer uma das CDRs 1, 2 e 3 das cadeias pesadas e leves pode ser caracterizada por uma sequência de pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos contíguos da mesma, e/ou como tendo uma sequência de aminoácido que compartilha pelo menos 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 85 %, 90 % ou 95 % de identidade de sequência com a CDR particular ou conjunto de CDRs listadas na SEQ ID NO correspondente.
[00217] Em um outro aspecto, fornecido é um anticorpo que compete quanto à LIGAÇÃO KIR3DL2 com um anticorpo monoclonal acima.
[00218] Em qualquer um dos anticorpos, as sequências de CDR e região variável específicas podem compreender uma, duas, três, quatro, cinco ou mais modificações de sequência conservativas. Modificações de sequência conservativas referem-se a modificações de aminoácido que não significativamente afetam ou alteram as características de ligação do anticorpo que contata a sequência de aminoácido. Tais modificações conservativas incluem substituições, adições e supressões de aminoácido. Modificações podem ser introduzidas em um anticorpo por técnicas padrão conhecidas no ramo, tais como mutagênese sítio-dirigida e mutagênese mediada por PCR. Substituições de aminoácido conservativas são tipicamente aquelas em que um resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido tendo uma cadeia lateral com propriedades físico-químicas similares. Sequências de CDR e região variável específicas podem compreender uma, duas, três, quatro ou mais inserções, supressões ou substituições de aminoácido. Onde substituições são feitas, substituições podem opcionalmente ser modificações conservativas. Famílias de resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais similares foram definidas na técnica. Estas famílias incluem aminoácidos com cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais beta- ramificadas (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim, um ou mais resíduos de aminoácido dentro das regiões CDR de um anticorpo podem ser substituídos com outros resíduos de aminoácido da mesma família de cadeia lateral e o anticorpo alterado pode ser testado quanto à função retida (isto é, as propriedades apresentadas aqui) usando os ensaios descritos aqui.
[00219] O termo “identidade” ou “idêntica”, quando usado em uma relação entre as sequências de dois ou mais polipeptídeos, refere-se ao grau de relação de sequência entre polipeptídeos, como determinado pelo número de combinações entre os filamentos de dois ou mais resíduos de aminoácido. “Identidade” mede a porcentagem de combinações idênticas entre a menor das duas ou mais sequências com alinhamentos de intervalo (se algum) tratados por um modelo matemático ou programa de computador particulares (isto é, “algoritmos”). A identidade de polipeptídeos relacionados pode ser facilmente calculada por métodos conhecidos. Tais métodos incluem, mas não são limitados àqueles descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nova Iorque, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nova Iorque, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., e Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nova Iorque, 1991; e Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988).
[00220] Métodos preferidos para determinar a identidade são designados para fornecer a maior combinação entre as sequências testadas. Métodos de determinar a identidade são descritos em programas de computador publicamente disponíveis. Métodos de programa de computador preferidos para determinar a identidade entre duas sequências incluem o pacote de programa GCG, incluindo GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, e FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). O programa BLASTX está publicamente disponível da National Center for Biotechnology Information (NCBI) e outras fontes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra). O algoritmo de Smith Waterman bem conhecido também pode ser usado para determinar a identidade.
[00221] As sequências das CDRs dos anticorpos, de acordo com AbM (definição do software de modelagem de anticorpo AbM da Oxford Molecular), sistemas de definição de Kabat e Chothia, foram resumidos nas Tabelas 1 para CDRs de cadeia pesada, e na Tabela 2 abaixo para CDRs de cadeia leve (CDRs de cadeia leve são as mesmas para cada uma das definições de AbM, Kabat e Chothia). As sequências de aminoácidos descritas aqui são numeradas de acordo com os sistemas de numeração de Abm, Kabat e Chothia. Embora qualquer sistema de numeração adequado possa ser usado para regiões CDR designadas, na ausência de qualquer outra indicação, a numeração de Abm pode ser usada. Tal numeração foi estabelecida usando as indicações seguintes: CDR-L1: Começo: aprox. resíduo 24, resíduo anterior: sempre um Cys, resíduo posterior: sempre um Trp (tipicamente Trp-Tyr-Gln, mas também, Trp-Leu-Gln, Trp-Phe-Gln, Trp-Tyr-Leu), comprimento: 10 a 17 resíduos; CDR-L2: Começo: sempre 16 resíduos depois do final de L1, Resíduos anteriores: geralmente Ile- Tyr (mas também, Val-Tyr, Ile-Lys, Ile-Phe), Comprimento: sempre 7 resíduos; CDR-L3, Começo: sempre 33 resíduos depois do final de L2, Resíduo anterior: sempre Cys, Resíduos posteriores: sempre Phe-Gly-Xaa-Gly, Comprimento: 7 a 11 resíduos; CDR-H1, Começo: aprox. resíduo 26 (sempre 4 depois um Cys) (definição de Chothia / AbM, a definição de Kabat começa 5 resíduos posteriores), Resíduos anteriores: sempre Cys-Xaa-Xaa-Xaa, Resíduos posteriores: sempre um Trp (tipicamente Trp-Val, mas também, Trp-Ile, Trp-Ala), Comprimento: 10 a 12 resíduos (definição de AbM, a definição de Chothia exclui os últimos 4 resíduos); CDR-H2, Começo: sempre 15 resíduos posteriores do final da definição de Kabat / AbM de CDR-H1, Resíduos anteriores: tipicamente Leu-Glu-Trp-Ile-Gly (mas várias variações, Resíduos posteriores Lys/Arg- Leu/Ile/Val/Phe/Thr/Ala-Thr/Ser/Ile/Ala), Comprimento: definição de Kabat 16 a 19 resíduos; definição de AbM (e Chothia) termina 7 resíduos antes; CDR-H3, Começo: sempre 33 resíduos posteriores do final de CDR-H2 (sempre 2 depois de um Cys), Resíduos anteriores: sempre Cys-Xaa-Xaa (tipicamente Cys-Ala- Arg), Resíduos posteriores: sempre Trp-Gly-Xaa-Gly, Comprimento: 3 a 25 resíduos.
[00222] Em uma forma de realização, os anticorpos são do isótipo de IgG1 humano ou de camundongo. Em uma outra forma de realização, os anticorpos são do isótipo de IgG1 humano. Em uma forma de realização, os anticorpos são fragmentos de anticorpo que mantêm sua ligação e/ou propriedades funcionais. Tabela 1
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Tabela 2
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[00223] As sequências das cadeias variáveis dos anticorpos são listadas na Tabela 3 abaixo, com as CDRs sublinhadas. Em qualquer forma de realização aqui, uma sequência de VL ou VH pode ser especificada ou numerada de modo a conter ou carecer de um peptídeo de sinal ou qualquer parte do mesmo.Tabela 3
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Fragmentos e derivados
[00224] Fragmentos e derivados de anticorpos (que são abrangidos pelo termo “anticorpo” ou “anticorpos” como usado neste pedido, a menos que de outro modo declarado ou claramente contradito pelo contexto), preferivelmente um anticorpo semelhante a 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 ou 20E9, pode ser produzido por técnicas que são conhecidas no ramo. “Fragmentos” compreendem uma porção do anticorpo intacto, geralmente o sítio de ligação ao antígeno ou região variável. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem os fragmentos Fab, Fab’, Fab’-SH, F(ab’)2, e Fv; diacorpos; qualquer fragmento de anticorpo que é um polipeptídeo tendo uma estrutura primária consistindo de uma sequência ininterrupta de resíduos de aminoácido contíguos (referidos aqui como um “fragmento de anticorpo de cadeia única” ou “polipeptídeo de cadeia única”), incluindo sem limitação (1) moléculas de Fv de cadeia única (2) polipeptídeos de cadeia única contendo apenas um domínio variável de cadeia leve, ou um fragmento do mesmo que contém as três CDRs do domínio variável de cadeia leve, sem uma porção de cadeia pesada associada e (3) polipeptídeos de cadeia única contendo apenas uma região variável de cadeia pesada, ou um fragmento da mesma contendo as três CDRs da região variável de cadeia pesada, sem uma porção de cadeia leve associada; e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo. Incluídos, inter alia, são um nanocorpo, anticorpo de domínio, anticorpo de domínio único ou um “dAb”.(a) Os fragmentos dos presentes anticorpos podem ser obtidos usando métodos padrão. Por exemplo, fragmentos Fab ou F(ab’)2 podem ser produzidos por digestão de protease dos anticorpos isolados, de acordo com técnicas convencionais. Será avaliado que fragmentos imunorreativos podem ser modificados usando métodos conhecido, por exemplo, para reduzir a liberação in vivo e obter um perfil farmacocinético mais desejável o fragmento pode ser modificado com polietileno glicol (PEG). Métodos para ligar e conjugar especificamente por sítio PEG a um fragmento Fab’ são descritos em, por exemplo, Leong et al, 16 (3): 106-119 (2001) e Delgado et al, Br. J. Cancer 73 (2): 175- 182 (1996), as divulgações dos quais são incorporadas aqui por referência.
[00225] Alternativamente, o DNA de um hibridoma que produz um anticorpo, preferivelmente um anticorpo semelhante a 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 ou 20E9, pode ser modificado de modo a codificar um fragmento. O DNA modificado depois é inserido em um vetor de expressão e usado para transformar ou transfectar uma célula apropriada, que depois expressa o fragmento desejado.
[00226] Em certas formas de realização, o DNA de um hibridoma que produz um anticorpo, preferivelmente um anticorpo semelhante a 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 ou 20E9, pode ser modificado antes da inserção em um vetor de expressão, por exemplo, substituindo-se a sequência de codificação no lugar de domínios constantes de cadeia pesada e leve humanos ao invés das sequências não humanas homólogas (por exemplo, Morrison et al., PNAS pp. 6851 (1984)), ou unindo-se covalentemente à sequência de codificação de imunoglobulina toda ou parte da sequência de codificação no lugar de um polipeptídeo que não de imunoglobulina. Nesta maneira, anticorpos “quiméricos” ou “híbridos” são preparados que têm a especificidade de ligação do anticorpo original. Tipicamente, tais polipeptídeos que não de imunoglobulina são substituídos no lugar dos domínios constantes de um anticorpo.
[00227] Assim, de acordo com uma outra forma de realização, o anticorpo, preferivelmente um anticorpo semelhante a 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 ou 20E9, é humanizado. Formas “humanizadas” de anticorpos são imunoglobulinas quiméricas específicas, cadeias de imunoglobulina ou fragmentos das mesmas (tais como Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2, ou outras subsequências de ligação ao antígeno dos anticorpos) que contêm sequência mínima derivada da imunoglobulina de murino. Geralmente, anticorpos humanizados são imunoglobulinas humanas (anticorpo receptor) em que resíduos de uma região determinante de complementaridade (CDR) do receptor são substituídos por resíduos de uma CDR do anticorpo original (anticorpo doador) enquanto mantendo a especificidade, afinidade, e capacidade desejadas do anticorpo original.
[00228] Em alguns exemplos, resíduos de estrutura Fv da imunoglobulina humana podem ser substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo receptor ou na sequências de CDR ou estrutura importadas. Estas modificações são feitas para refinar e otimizar ainda mais o desempenho do anticorpo. Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, em que todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas do anticorpo original e todas ou substancialmente todas as regiões de FR são aquelas de uma sequência de consenso de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado idealmente também compreenderá pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquela de uma imunoglobulina humana. Para mais detalhes ver Jones et al., Nature, 321, pp. 522 (1986); Reichmann et al, Nature, 332, pp. 323 (1988); Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2, pp. 593 (1992); Verhoeyen et Science, 239, pp. 1534; e Patente U.S. No 4.816.567, as divulgações inteiras dos quais são aqui incorporadas por referência.)
[00229] A escolha de domínios variáveis humanos, tanto leves quanto pesados, a serem usados em preparar os anticorpos humanizados é muito importante para reduzir a antigenicidade. De acordo com o assim chamado método de “melhor ajuste”, a sequência do domínio variável de um anticorpo é triada contra a biblioteca inteira de sequências de domínio variável humanas conhecidas. A sequência humana que é mais próxima daquela do camundongo é depois aceita como a estrutura humana (FR) para o anticorpo humanizado (Sims et al., J. Immunol. 151, pp. 2296 (1993); Chothia e Lesk, J. Mol. 196, 1987, pp. 901). Um outro método usa uma estrutura particular da sequência de consenso de todos os anticorpos humanos de um subgrupo particular de cadeias leves ou pesadas. A mesma estrutura pode ser usada para vários anticorpos humanizados diferentes (Carter et al., PNAS 89, pp. 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol., 151, p. 2623 (1993)).
[00230] É importante ainda que os anticorpos sejam humanizados com retenção de afinidade alta para receptores de KIR3DL2 e outras propriedades biológicas favoráveis. Para obter este objetivo, de acordo com um método exemplar, anticorpos humanizados são preparados por um processo de analise das sequências precursoras e vários produtos humanizados conceituais usando modelos tridimensionais das sequências precursoras e humanizadas. Modelos de imunoglobulina tridimensionais estão comumente disponíveis e são familiares àqueles habilitados na técnica. Programas de computador estão disponíveis que ilustram e exibem estruturas tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção destas exibições permite a analise do papel provável dos resíduos no funcionamento da sequência de imunoglobulina candidata, isto é, a analise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata de ligar-se ao seu antígeno. Deste modo, resíduos de FR podem ser selecionados e combinados a partir das sequências de consenso e importação de modo que a característica do anticorpo desejada, tal como afinidade aumentada pelo(s) antígeno(s) alvo(s), seja obtida. Em geral, os resíduos de CDR estão diretamente e o mais substancialmente envolvidos em influenciar a ligação ao antígeno.
[00231] Um outro método de fabricar anticorpos monoclonais “humanizados” é usar um hospedeiro de murino de acordo com o que tem tido seus genes de imunoglobulina substituídos por genes de imunoglobulina humana funcionais (ver, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No 6.162.963, que é aqui incorporada em sua totalidade por referência).
[00232] Anticorpos humanos também podem ser produzidos de acordo com várias outras técnicas, tais como usando-se, para imunização, outros animais transgênicos que foram engendrados para expressar um repertório de anticorpo humano (Jakobovitz et al., Nature 362 (1993) 255), ou por seleção de repertórios de anticorpo usando métodos de exibição de fago. Tais técnicas são conhecidas à pessoa habilitada e podem ser executadas partindo de anticorpos monoclonais como divulgado aqui.
[00233] Os anticorpos, opcionalmente um anticorpo semelhante a 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 5H1, 1E2, 1C3 ou 20E9, também pode ser derivado de anticorpos “quiméricos” (imunoglobulinas) em que uma porção da(s) cadeia(s) pesada(s)/leve(s) é idêntica com ou homóloga a sequências correspondentes no anticorpo original, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é idêntico com ou homólogo a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma outra espécie ou pertencendo a uma outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, contanto que eles exibam a atividade biológica e especificidade de ligação desejadas (Cabilly et al., supra; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., pp. 6851 (1984)).
[00234] Várias formas do anticorpo humanizado ou anticorpo amadurecido por afinidade são consideradas. Por exemplo, o anticorpo humanizado ou anticorpo amadurecido por afinidade podem ser um fragmento de anticorpo, tal como um Fab. Alternativamente, o anticorpo humanizado ou anticorpo amadurecido por afinidade podem ser um anticorpo de tamanho natural ou intacto, tal como um anticorpo de IgG1 ou IgG4 de tamanho natural ou intacto. Em uma forma de realização, o anticorpo humanizado é um anticorpo de IgG4 de tamanho natural ou um fragmento do mesmo. Para produzir tais anticorpos, regiões VH e VL humanizadas, ou versões de variantes das mesmas, podem ser clonadas em vetores de expressão que codificam regiões constantes de tamanho natural ou truncadas de um anticorpo humano de acordo com métodos recombinantes padrão (ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989). O resultado é uma linhagem de célula transfectada que expressa e secreta a molécula de anticorpo humanizado de interesse, que compreende as regiões VH e VL e regiões constantes selecionadas. Sequências de cDNA que codificam as regiões constantes de anticorpos humanos são conhecidas.
[00235] A região constante pode ser modificada ainda de acordo com métodos conhecidos. Por exemplo, em uma região constante de IgG4, o resíduo S241 pode ser mutado a um resíduo de prolina (P) para permitir a formação de ponte de dissulfeto completa na dobradiça (ver, por exemplo, Angal et al., Mol Immunol. 1993;30:105-8).
Regiões constantes modificadas
[00236] Em vista da capacidade dose anticorpos anti-KIR3DL2 (particularmente os anticorpos que não de internalização) induzem ADCC e CDC, os anticorpos também podem ser feitos com modificações que aumentam sua capacidade dos receptores de Fc que podem afetar as funções efetoras tais como toxicidade dependente de anticorpo, desgranulação de mastóide, e fagocitose, bem como sinais imunomodulatórios tais como regulação da proliferação de linfócitos e secreção de anticorpos. As modificações típicas incluem regiões constantes de IgG1 humano modificado que compreendem pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, substituição, exclusões, inserções), e/ou tipos alterados de glicosilação, por exemplo, hipofucosilação. Tais modificações podem afetar a interação com os receptores de Fc : FcyRI (CD64), FeyRII (CD32), e FeyRIII (CD 16). FcyRI (CD64), FcyRIIA (CD32A) e FcyRIII (CD 16) são receptores de ativação (isto é, melhoradores do sistema imune) enquanto FcyRIIB (CD32B) é um receptor de inibição (isto é, amortecimento do sistema imune). Uma modificação pode, por exemplo, aumentar a ligação do domínio Fc para FcyRIIIa nas células efetoras (por exemplo, NK).
[00237] Os anticorpos Anti-KIR3DL2 preferivelmente compreendem um domínio Fc (ou porção dos mesmos) de IgG1 humano ou isótipo de IgG3, opcionalmente modificado. Os resíduos 230-341 (Kabat EU) são a região Fc CH2. Os resíduos 342-447 (Kabat EU) são a região Fc CH3. Os anticorpos Anti- KIR3DL2 podem compreender uma variante da região Fc tendo uma ou mais modificações de aminoácido (por exemplo, substituições, exclusões, inserções) em uma ou mais porções, cujas modificações aumentam a afinidade e avidez da região Fc variante para um FcyR (incluindo FcyRs de ativação e inibidores). Em algumas formas de realização, a dita uma ou mais modificações de aminoácido aumentam a afinidade da região de Fc variante para FcyRIIIA e/ou FcyRIIA. Em outra forma de realização, a região de Fc variante também liga especificamente FeyRIIB com uma afinidade menor do que da região Fc do anticorpo precursor comparável (por exemplo, um anticorpo tendo a mesma sequência de aminoácido que o anticorpo exceto para a uma ou mais modificações de aminoácido na região Fc). Por exemplo, um ou ambos os resíduos de histidina nas posições de aminoácido 310 e 435 podem ser substituídos, por exemplo, por lisina, alanina, glicina, valina, leucina, isoleucina, prolina, metionina, triptofano, fenilalanina, serina ou treonina (ver, por exemplo, Publicação PCT No WO 2007/080277); tais regiões constantes substituídas fornecem a ligação diminuída aos inibidores FcyRIIB sem diminuir a ligação ao FcyRIIIA ativador. Em algumas formas de realização, tais modificações aumentam a afinidade da região de Fc variante para FcyRIIIA e/ou FeyRIIA e também aumentam a afinidade da região de Fc variante para FcyyRIIB em relação ao anticorpo precursor. Em outras formas de realização, a dita uma ou mais modificações de aminoácido aumentam a afinidade da região de Fc variante para FcyRIIIA e/ou FcyRIIA mas não alteram a afinidade das regiões de Fc variantes para FeyRIIB em relação à região Fc do anticorpo precursor. Em outra forma de realização, a dita uma ou mais modificações de aminoácido aumentam a afinidade da região de Fc variante para FcyRIIIA e FeyRIIA mas reduzem a afinidade para FeyRIIB em relação ao anticorpo precursor. A afinidade e/ou avidez aumentadas resultam na ligação detectável para a atividade relacionada a FeyR ou FcyR- nas células que expressam baixos níveis do FeyR quando a atividade de ligação da molécula precursor (sem a região Fc modificada) não pode ser detectada nas células.
[00238] As afinidades e propriedades de ligação dos anticorpos para um FcyR podem ser determinadas usando ensaios in vitro (ensaios com base em bioquímicos ou biológicos) conhecidos na técnica para determinar as interações de anticorpo-antígeno ou interações Fc-FeyR, isto é, a ligação específica de um antígeno a um anticorpo ou ligação específica de uma região Fc a um FcyR, respectivamente, incluindo mas não limitando a um ensaio ELISA, ensaio de ressonância de plásmon de superfície, ensaios de imunoprecipitação .
[00239] Em algumas formas de realização, os anticorpos que compreendem uma região de Fc variante compreendem pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, possuindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou mais modificações de aminoácido) no domínio CH3 da região Fc. Em outras formas de realização, os anticorpos que compreendem uma região de Fc variante compreendem pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, possuindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou mais modificações de aminoácido) no domínio CH2 da região Fc, que é definida como se estendendo a partir dos aminoácidos 231-341. Em algumas formas de realização, os anticorpos compreendem pelo menos duas modificações de aminoácido (por exemplo, possuindo 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou more modificações de aminoácido), em que pelo menos uma tal modificação é na região CH3 e pelo menos uma tal modificação é na região CH2. Também são abrangidas as modificações de aminoácido na região de dobradiça. Em uma forma de realização, são abrangidas as modificações de aminoácido no domínio CH1 da região Fc, que é definida como se estendendo a partir dos aminoácidos 216-230.
[00240] Qualquer combinação das modificações de Fc podem ser feitas, por exemplo qualquer combinação de modificações diferentes divulgadas nas Patentes dos Estados Unidos Nos US, 7.632.497; 7.521.542; 7.425.619; 7.416.727; 7.371.826; 7.355.008; 7.335.742; 7.332.581; 7, 183.387; 7.122.637; 6.821.505 e 6.737.056; nas Publicações PCT Nos. WO 2011/109400; WO 2008/105886; WO 2008/002933; WO 2007/021841; WO 2007/106707; WO 06/088494; WO 05/115452; WO 05/110474; WO 04/1032269; WO 00/42072; WO 06/088494; WO 07/024249; WO 05/047327; WO 04/099249 e WO 04/063351; e em Presta, L.G. et al. (2002) Biochem. Soc. Trans. 30(4):487490; Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 26; 277(30):26733-26740 e Shields, R.L. et al. (2001) J. Biol. Chem. 276(9):6591-6604).
[00241] Os anticorpos anti-KIR3DL2 podem compreender uma região de Fc variante, em que a região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, possuindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou mais modificações de aminoácido) em relação a uma região Fc de tipo selvagem, tal que a molécula tem uma função efetora realçada em relação a uma molécula que compreende uma região de Fc do tipo selvagem, opcionalmente em que a região de Fc variante compreende uma substituição em qualquer uma ou mais das posições 221, 239, 243, 247, 255, 256, 258, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 300, 301, 303,305, 307, 308, 309, 310, 311, 312, 316, 320, 322, 326, 329, 330, 332, 331, 332,333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 359, 360, 370, 373, 376, 378, 392, 396, 399,402, 404, 416, 419, 421, 430, 434, 435, 437, 438 e/ou 439. Em uma forma de realização, os anticorpos anti-KIR3DL2 podem compreender uma região de Fc variante, em que a região de Fc variante compreende pelo menos uma modificação de aminoácido (por exemplo, possuindo 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou mais modificações de aminoácido) em relação à um região de Fc do tipo selvagem, tal que a molécula tem uma função efetora realçada em relação a uma molécula que compreende uma região de Fc do tipo selvagem, opcionalmente em que a região de Fc variante compreende uma substituição em qualquer uma ou mais das posições 329, 298, 330, 332, 333 e/ou 334 (por exemplo, substituições S239D, S298A, A330L, 1332E, E333A e/ou K334A).
[00242] Em uma forma de realização, os anticorpos tendo regiões de Fc variantes ou do tipo selvagem podem ter padrões de glicosilação alterados que aumentam a capacidade de ligação do receptor de Fc dos anticorpos. Tais modificações de carboidrato podem ser efetuadas, por exemplo, expressando o anticorpo em uma célula hospedeira com um mecanismo de glicosilação alterado. As células com mecanismo de glicosilação alterado foram descritos na técnica e podem ser usados como células hospedeiras em que expressam anticorpos recombinantes para deste modo produzir um anticorpo com glicosilação alterada. Ver, por exemplo, Shields, R.L. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740; Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-1, bem como, Patente Européia No: EP 1.176.195; Publicações PCT WO 06/133148; WO 03/035835; WO 99/54342, cada uma a qual é aqui incorporada por referência na sua totalidade.
[00243] Geralmente, tais anticorpos com glicosilação alterada são "glico- otimizados" tal que o anticorpo tem uma estrutura de N-glicano particular que produz algumas propriedades desejáveis, incluindo mas não limitando a, ADCC aperfeiçoado e atividade de ligação do receptor da célula efetora quando comparado aos anticorpos não modificados ou anticorpos tendo uma região constante de ocorrência natural e produzidos pelo mieloma NSO de murino e células de ovário de Hamster chinês (CHO) (Chu and Robinson, Current Opinion Biotechnol. 2001, 12: 180-7), os anticorpos expressados em HEK293T anticorpos como aqui produzidos na seção de Exemplos, ou outras linhagens de célula de hospedeiro mamífero comumente usadas para produzir anticorpos terapêuticos recombinantes.
[00244] Os anticorpos monoclonais produzidos em células hospedeiras mamíferas contêm um local de glicosilação N-ligados em Asn297 de cada cadeia pesada. Os glicanos nos anticorpos são estruturas biantenais tipicamente complexas com N-acetilglucosamina muito baixa ou nenhuma bissecção (bissecção de G1cNAc) e altos níveis de fucosilação nuclear. Os terminais de glicano contêm muito pouco ou nenhum ácido siálico terminal e quantidades variáveis de galactose. Para uma revisão dos efeitos de glicosilação na função do anticorpo, ver, por exemplo, Wright & Morrison, Trend Biotechno1,15:26- 31(1997). Um trabalho considerável mostra que mudanças na estrutura do glicano do anticorpo de composição de sugar pode alterar as funções efetoras de Fc. As estruturas de carboidrato importantes que contribuem para a atividade do anticorpo são acreditadas ser os resíduos de fucose ligados por intermédio da ligação alfa-1,6 ligação aos resíduos de N-acetilglucosamina (GlacNAc) mais internos dos oligossacarídeos N-ligados da região Fc (Shields et al., 2002). Os anticorpos tendo um teor de frutose diminuído nos glicanos N-ligados (glicanos ligados em N hipofucosilados) podem ser, portanto, produzidos.
[00245] A ligação de Fc7R requer a presença de oligossacarídeos covalentemente ligados no Asn297 conservado na região Fc do IgGl, IgG2 ou IgG3 tipo humano. As estruturas de oligossacarídeos não fucolisadas foram recentemente associadas com atividade de ADCC in vitro dramaticamente aumentada. "Asn 297" se refere ao aminoácido asparagina localizado em torno da posição 297 na região Fc; com base nas variações de sequências menores dos anticorpos, Asn297 também pode estar localizado em alguns aminoácidos (geralmente não mais do que +3 aminoácidos) a montante ou a jusante.
[00246] Historicamente, os anticorpos produzidos nas células CHO contêm cerca de 2 a 6 % na população que é não fucosilada. As linhagens de célula YB2/0 (mieloma de rato) e Lec13 (um mutante de lectina da linha CHO que tem uma manose 4,6-deidratase deficiente em GDP levando à deficiência de GDP- fucose ou intermediários de açúcar de GDP que são o substrato de alfa-6- fucosiltransferase foram relatados produzir anticorpos com de 78 a 98 % de espécies não fucosilados. Em outros exemplos, a interferência de RNA (RNAi) ou técnicas de silenciamento podem ser utilizadas para engendrar células para diminuir os níveis de transcritos de mRNA FUT8 ou silenciamento da expressão de gene inteiramente, e tais anticorpos foram relatados conter até 70 % de glicano não fucosilado.
[00247] Uma ligação de anticorpo para KIR3DL2 pode ser glicosilada com uma CADEIA DE açúcar a Asn297, o dito anticorpo mostrando afinidade de ligação aumentada por intermédio de sua porção Fc a Fc7RIII. Em uma forma de realização da invenção, um anticorpo compreenderá uma região constante que compreende pelo menos uma alteração de aminoácido na região Fc que melhora a ligação de anticorpo para FcyRIIIa e/ou ADCC.
[00248] Em um aspecto, os anticorpos são hipofucosilados na sua região constante. Tais anticorpos podem compreender uma alteração de aminoácido ou podem não compreender uma alteração de aminoácido mas se produzidos ou tratados sob condições de modo a produzir tal hipofucosilação. Em um aspecto, uma composição de anticorpo compreende um anticorpo quimérico, humano ou humanizado aqui descrito, em que pelo menos 20, 30, 40, 50, 60, 75, 85, 90, 95 % ou substancialmente todas as espécies de anticorpo na composição possuem uma região constante que compreende uma estrutura de carboidrato nucelar (por exemplo, estruturas de manose complexas, híbridas e de alta manose) que carece de fucose. Em uma forma de realização, é fornecido uma composição de anticorpo que é isente de anticorpos que compreendem uma estrutura de carboidrato nucelar tendo fucose. O carboidrato nucelar preferivelmente será uma cadeia de açúcar em Asn297.
[00249] Em uma forma de realização, é fornecido uma composição de anticorpo, por exemplo, uma composição que compreende anticorpos que ligam a KIR3DL2, são glicosilados com uma cadeia de açúcar em Asn297, em que os anticorpos são parcialmente fucosilados. Os anticorpos fucosilados são caracterizados em que a proporção de anticorpos anti-KIR3DL2 na composição que carece de fucose dentro da cadeia de açúcar em Asn297 é entre 20 % e 90 %, preferivelmente entre 20 % e 80 %, preferivelmente entre 20 % e 50 %, 55 %, 60 %, 70 % ou 75 %, entre 35 % e 50 %, 55 %, 60 %, 70 % ou 75 %, ou entre 45 % e 50 %, 55 %, 60 %, 70 % ou 75 %. Preferivelmente o anticorpo é do tipo IgG1 ou IgG3 humano.
[00250] A cadeia de açúcar também pode apresentar qualquer característica (por exemplo, presença e proporção das estruturas de manose complexa, híbridas e de alta manose), incluindo as características de glicanos N-ligados ligados a Asn297 de um anticorpo de uma célula humana, ou de um anticorpo expressado de maneira recombinante em uma célula de roedor, célula de murino (por exemplo, célula de CHO) ou em uma célula de aves.
[00251] Em uma forma de realização, o anticorpo é expressado em uma célula que está carecendo de uma enzima de fucosiltransferase tal que a linhagem de células produz proteínas que carecem de fucose nos seus carboidratos nucleares. Por exemplo, as linhagens de célula Ms704, Ms705, e Ms709 carecem do gene de fucosiltransferase, FUT8 (alfa (1,6) fucosiltransferase), tal que os anticorpos expressados nas linhagens de célula Ms704, Ms705, linhagens de célula Ms709 carecem de fucose nos seus carboidratos nucleares. Estas linhagens de célula foram criadas pelo rompimento alvejado do gene FUT8 nas células CHO/DG44 usando dois vetores de substituição (ver a Publicação de Patente U.S. No. 20040110704 pela Yamane et al.; e Yamane-Ohnuki et al. (2004) Biotechnol Bioeng 87:614-22, divulgações as quais são aqui incorporadas por referência). Outros exemplos incluíram o uso da supressão de anti-sentido, interferência de RNA de duplo filamento (dsRNA), interferência de RNA de grampo de cabelo (hpRNA) ou interferência de RNA grampo de cabelo contendo intron (ihpRNA) para romper funcionalmente o gene FUT8. Em uma forma de realização, o anticorpo é expressado em uma linhagem de células com um gene FUT8 funcionalmente rompido, que codifica um fucosil transferase, tal que os anticorpos expressados em tal linhagem de células apresentam hipofucosilação reduzindo-se ou eliminando-se a enzima relacionada com a ligação alfa 1,6.
[00252] Em uma forma de realização, o anticorpo é expressado nas linhagens de célula engendrado para expressar as glicosil transferases que modificam a glicoproteína (por exemplo, beta(1,4)-N-acetilglicosaminil-transferase III (GnTHI)) tal que os anticorpos expressados nas linhagens de célula engendradas apresentam estruturas de GlcNac aumentadas divididas em duas partes iguais que resultam na atividade de ADCC aumentada dos anticorpos (Publicação PCT WO 99/54342 por Umana et al.; e Umana et al. (1999) Nat. Biotech. 17:176-180, divulgações as quais são aqui incorporadas por referência).
[00253] Em outra forma de realização, o anticorpo é expressado e o(s) resíduo(s) de fucosila é(são) clivados usando uma enzima de fucosidase. Por exemplo, a fucosidase alfa-L- fucosidase remove os resíduos de fucosil dos anticorpos (Tarentino, et al. (1975) Biochem. 14:5516-5523). Em outros exemplos, uma linhagem de células que produze um anticorpo pode ser tratada com um inibidor de glicosilação; Zhou et al. Biotech. and Bioengin. 99: 652-665 (2008) descreveu o tratamento das células de CHO com o inibidor de alfa- manosidase I, cifunensina (kifunensine), resultando na produção de anticorpos com N-glicanos tipo oligomanosenona fucosilados.
[00254] Em uma forma de realização, o anticorpo é expressado em uma linhagem de células que naturalmente tem uma baixa atividade de enzima para adicionar fucosila à N-acetilglucosamina que se liga à região Fc do anticorpo ou não tem a atividade enzimática, por exemplo, a linhagem de células de mieloma de rato YB2/0 (ATCC CRL 1662). Outro exemplo de linhagem de células incluem uma linhagem de células de CHO variante, células Led 3, com capacidade reduzida de ligar a fucosila aos carboidratos ligados ao Asn(297), também resultando na hipofucosilação de anticorpos expressados naquela célula hospedeira (WO 03/035835 (Presta et al); e Shields, RX. et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740, divulgações as quais são aqui incorporadas por referência). Em outra forma de realização, o anticorpo é expressado em uma célula de aves, preferivelmente uma célula EBx® (Vivalis, França) que naturalmente produz os anticorpos com baixo teor de fucose por exemplo, WO2008/142124. Os glicanos hipofucosilados também podem ser produzidos nas linhagens de células de origem vegetal, por exemplo, WO 07/084926A2 (Biolex Inc.), WO 08/006554 (Greenovation Biotech GMBH), divulgações as quais são aqui incorporadas por referência.
Usos em diagnósticos e terapias
[00255] Em algumas formas de realização, os presentes anticorpos são usados para purificar ou identificar as células positivas de KIR3DL2 a partir de uma amostra biológica. Amostras biológicas podem ser obtidas a partir de um paciente, por exemplo, para propósitos de diagnóstico ou terapêuticos ex vivo, ou a partir de indivíduos ou primatas não humanos para obter uma fonte de tais células para propósitos de pesquisa.
[00256] As células KIR3DL2 positivas podem ser purificadas ou identificadas usando os presentes anticorpos com qualquer variedade de métodos padrão. Por exemplo, as células sanguíneas periféricas podem ser sortidas usando um escaner FACS usando anticorpos rotulados específicos para KIR3DL2, e opcionalmente para outras moléculas de superfície celular tipicamente presentes nas células, por exemplo, CD4, CD8 ou CD30 para a T célula; CD4 CD2+, CD3+, CD5+, CD8-, CD28+, CD45RO+ e/ou TCRoc13+ para células malignas na Síndrome de Sezary; CD4+ (opcionalmente CD4+ e CD28-) em doenças inflamatórias, autoimunes ou doenças cardiovasculares.
[00257] Além disso, os anticorpos podem ser conjugados ou covalentemente ligados a um suporte sólido e usados para purificar ou identificar as células positivas de KIR3DL2 ou quaisquer células que expressam KIR3DL2 a partir de uma amostra biológica, por exemplo, a partir de uma amostra sanguínea ou biópsia de tecido de mucosa de um paciente ou outro indivíduo. Especificamente, a amostra biológica é colocada em contato com os anticorpos sob condições que permitem que as células dentro da amostra liguem ao anticorpo, e depois as células são eluídas a partir do anticorpo ligado ao suporte sólido.
[00258] Sem considerar o método usado para isolar, purificar ou identificar as células positivas KIR3DL2, a capacidade de fazê-lo é útil para vários propósitos, por exemplo, para diagnosticar um distúrbio caracterizado por uma expansão patógena das células que expressam KIR3DL2, avaliando-se o número ou a atividade ou outras características das células positivas de KIR3DL2 obtidas a partir de um paciente, ou para avaliar a capacidade dos anticorpos, ou fragmentos ou derivados dos mesmos, de modular a atividade ou comportamento das células de um paciente antes, por exemplo, de um dos tratamentos aqui descritos usando os anticorpos. Além disso, as células KIR3DL2 positivas são úteis em um contexto de pesquisa, por exemplo, para melhor caracterizar as células e suas várias propriedades e comportamentos, bem como identificar compostos ou métodos que podem ser usados para modular seu comportamento, atividade, ou proliferação. Os anticorpos também podem ser úteis nos métodos de diagnóstico, por exemplo, nos métodos de detectar os polipeptídeos KIR nas células, por exemplo, células doentes de um paciente.
[00259] A presente divulgação também fornece as composições farmacêuticas que compreendem um anticorpo que especificamente liga ao polipeptídeo KIR3DL2s na superfície das células. O anticorpo preferivelmente inibe o crescimento ou atividade (por exemplo, produção de citocina) das células e/ou leva à eliminação das células positive KIR3DL2, preferivelmente por intermédio da indução de CDC e/ou ADCC. A composição também compreende um carregador farmaceuticamente aceitável.
[00260] A divulgação também fornece um método de inibir o crescimento ou atividade de, e/ou esgotamento, células positivas de KIR3DL2, em um paciente em necessidade do mesmo, compreendendo a etapa de administrar ao dito paciente uma composição aqui descrita. Tais métodos de tratamento podem ser usados para vários distúrbios, incluindo, mas não limitando a CTCL, SS e MF, distúrbios inflamatórios, autoimunes e cardiovasculares.
[00261] Sem considerar a forma do CD4+ CTCL, existem celular CD4+ T malignas que expressam KIR3DL2 na sua superfície. KIR3DL2 deste modo cobre a faixa de CD4+ CTCL, e notavelmente a Síndrome de Sezary ("SS"), Micose Fungóide transformada ("MF transformada"), Pápula Linfomatóide ("LP"), e linfomas CD30+.
[00262] Um diagnóstico (por exemplo, um diagnóstico de CTCL) pode ser fundamentado na análise da presença de KIR3DL2 na superfície das células CD4+ coletadas da área suspeita do corpo (por exemplo, amostra do eritroderma da pele quando MF tranformado é suspeitado, ou a amostra do sangue periférico quando uma forma de CTCL mais agressiva, tal como SS, é suspeita). Pode ser tipicamente concluído que uma célula CD4+ T é tumoral tão logo existam polipeptídeos KIR3DL2s detectados na superfície destas células CD4+ T. A porcentagem de célula T CD4+ de KIR3DL2+ pode ser medida em uma amostra de sangue periférico coletada de um paciente a partir do qual um SS é suspeito, e tal porcentagem será substancialmente correspondente à porcentagem de células SS malignas que estão atualmente presentes no sangue periférico deste paciente (geralmente dentro de uma faixa ±10 % ou mesma uma faixa ±5 % para KIR3DL2+, células CD4+. KIR3DL2 e os anticorpos anti- KIR3DL2 aqui anteriormente descritos podem ser usados na plataforma da doença, particularmente SS.
[00263] Na medida em que como KIR3DL2 é um marcador universal para CTCL, os anticorpos podem ser usados em combinação com outros tratamentos ou marcadores de diagnóstico para CTCL. Por exemplo, o CD30 quando presente na superfície das células T CD4+ malignas indica que o paciente tem uma forma particular de CTCL CD4+ que é indicado na técnica como linfoma CD30+. O CD30 é, portanto, um marcador de CTCL para uma forma particular de CTCL (linfomas CD30+), contudo o CD30 não cobre toda forma de CTCL CD4+ visto que para o CTCL CD4+ tal como SS, MF transformado, ou LP, não existe necessariamente uma célula T CD4+ maligna que expressaria CD30 na sua superfície. CD30 pode, portanto, ser usado além do KIR3DL2 como um marcador no diagnóstico e terapia de CTCL. Além disso, uma descoberta de que um paciente tem CTCL CD4+ que expressa CD30 pode indicar que o paciente é adequado para o tratamento com um anticorpo anti-KIR3DL2 e um anticorpo anti- CD30; opcionalmente, o paciente pode ser então tratado com um anticorpo anti- KIR3DL2 e um anticorpo anti-CD30.
[00264] Em algumas formas de realização, antes da administração do anticorpo ou composição de anti-KIR3DL2, a presença de CD2, CD3, CD4, CD5, CD8, CD28, CD30, CD45RO e/ou TCRocr3 será avaliada nas células (por exemplo, células patogênicas) de um paciente. Um paciente cujas as células expressam (ou não expressam, de acordo com o distúrbio particular e células procuradas para ser alvejadas) um marcador pode então ser tratado com um anticorpo ou composição de anti-KIR3DL2. Em algumas formas de realização, antes da administração do anticorpo ou composição de anti-KIR3DL2, a presença de KIR3DL2 nas células do paciente será avaliada, por exemplo, para determinar o nível e atividade relativos das células positivas em KIR3DL2 no paciente bem como para confirmar a eficácia de ligação dos anticorpos para as células do paciente. Um paciente cujas células expressam KIR3DL2 podem ser então tratados com um anticorpo ou composição de anti-KIR3DL2. Isto pode ser efetuado através da obtenção de uma amostra de PBLs ou células no local do distúrbio, e testando, por exemplo, usando imunoensaios, para determinar a proeminência relativa dos marcadores, tais como CD4, CD8, CD30 ou KIR3DL2 nas células.
[00265] Em uma forma de realização, onde é procurado inibir a atividade ou crescimento das, ou esgotar, as células positivas em KIR3DL2 do paciente, a capacidade do anticorpo anti-KIR3DL2 de inibir a proliferação ou esgotamento de uma célula positiva em KIR3DL2 do paciente é avaliada. Se as células positivas em KIR3DL2 são esgotadas pelo anticorpo ou composição anti-KIR3DL2, o paciente é determinado ser responsivo à terapia com um anticorpo ou composição de anti-KIR3DL2, e opcionalmente, o paciente é tratado com um anticorpo ou composição anti-KIR3DL2.
[00266] Em algumas formas de realização, o método pode compreender a etapa adicional de administrar ao dito paciente um agente terapêutico adicional apropriado (segundo) selecionado de um agente imunomodulatório, um agente imunossupressivo, um agente hormonal, um agente quimioterapêutico, um segundo anticorpo (por exemplo, um anticorpo de esgotamento) que se liga a um polipeptídeo presente em uma célula que expressa KIR3DL2. Tais agentes adicionais podem ser administrados ao dito paciente como uma forma de dosagem única junto com o dito anticorpo, ou como uma forma de dosagem separada. A dosagem do anticorpo (ou anticorpo e a dosagem do agente terapêutico adicional coletivamente) é suficiente para induzir, promover, e/ou aumentar detestavelmente uma resposta terapêutica no paciente. Onde separadamente administrados, o anticorpo, fragmento, ou derivado e o agente terapêutico adicional são desejavelmente administrados sob condições (por exemplo, com relação ao tempo, número de doses, etc.) que resultam em um benefício terapêutico combinado detectável ao paciente.
[00267] A micose fungóide e a síndrome de Sezary mais agressiva representam a maioria das formas comuns de CTCL. O curso clínico de MF/SS é geralmente indolente, com áreas eritematosas pruríticas que se desenvolvem lentamente durante longos períodos. Eventualmente, contudo, a área eritematosa se torna progressivamente infiltrada, se desenvolvendo em placas e finalmente a tumores ulcerantes. O prognóstico da MF/SS é baseado na extensão da doença na apresentação. Os pacientes com a doença no estágio I possuem uma sobrevivência média de 20 anos ou mais, em comparação com uma sobrevivência média de aproximadamente 3 a 4 anos para pacientes com a doença no estágio III/IV.
[00268] As composições aqui descritas podem ser usadas para o tratamento em combinação com qualquer agente conhecido ser útil no tratamento da malignidade da célula T particular. Vários tratamentos para CTCL estão em uso, incluindo corticosteróides, mostarda nitrogenada, carmustina, tacrolimus tópico (Protopic®), imiquimod (Aldara®; 3M Inc.), retinóides tópicos, e rexinóides (bexaroteno; Targretin®; Ligand Pharmaceuticals, San Diego, CA)), bem como terapia de luz ultravioleta (Psoralen + UVA (PUVA), UVB de banda estreita, e UVB), Terapia fotodinâmica (PDT) e irradiação de corpo. Os tratamentos também incluem inibidores de histona desacetilase tais como vorinostat (ácido suberoilanilida hidroxâmico, Zolinza®) e Romidepsina (depsipeptídeo, FK-228, Istodax®), um peptídeo cíclico que inibe seletivamente os isótipos de desacetilase histona 1, 2, 4 e 6. Quimioterapia ou quimioterapia de combinação também são usadas. Os exemplos incluem gencitabina, análogos de antifoliato tais como Pralatrexato (Folotyn®). Outras terapias incluem IMiDs (medicamentos imunomodulatórios), análogos derivados de talidomida que possuem uma ampla faixa de efeitos, incluindo efeitos tanto imune quanto não imune. Representativos da classe de IMiD incluem CC-5013 (lenalidomida; Revlimid®), CC-4047 (Actimid), e ENMD-0995. Outros tratamentos incluem inibidores de proteossoma tais como bortezomib (Velcade®), um inibidor de proteassoma reversível 26S. O transplante de células tronco também é usado.
[00269] Embora não exista um padrão atual de cuidado para MF/SS, existe uma tendência geral de confiar nas intervenções tópicas para atrasos sistêmicos da doença em estado inicial e mais a terapia tóxica até o desenvolvimento de sintomas extensivos. Psoralen e radiação ultravioleta A (PUVA), combinados ou não com baixas doses de interferon-a, são eficazes em MF/SS no estágio inicial, para induzir a remissão completa (CR) na maioria dos pacientes. A radioterapia local ou irradiação de feixe eletrônico de pele total (TSEB) foi usada com sucesso para controlar a doença de pele avançada. A fotoforese extra corporal também pode ser usada com sucesso mas não é geralmente disponível. Uma vez que a doença se torna refratária à terapia tópica, a interferon-a, o bexaroteno rexinóide (Targretin®, Ligand Pharmaceuticals, San Diego, CA), um análogo retinóide sintético que alveja o receptor retinóide X, quimioterapia de agente único ou quimioterapia de combinação podem ser dados. Os tratamentos, particularmente terapias direcionadas à pele, incluem, por exemplo, corticosteróides, mostarda nitrogenada, carmustina, tacrolimus tópico (Protopic®) e imiquimod (Aldara®; 3M Inc.). A duração de resposta é, contudo, frequentemente de menos do que 1 ano, e enfim, todos os pacientes têm recaídas e a doença se torna refratária. A toxina IL2-difteria recombinante denileukin diftitox (DAB389IL-2, ONTAK®, Ligand Pharmaceuticals, San Diego, CA) é ativa em pacientes com CTCL do estágio Ib até o estágio IV refratário para os tratamentos prévios(resposta objetiva global em 30 % de 71 pacientes com uma resposta de duração média de 7 meses) e parece ter um efeito benéfico no alívio dos sintomas e qualidade de vida. Mais recentemente, denileukin diftitox foi testado em um teste de Fase I em combinação com bexarotena, visto que esta induz a supre regulagem de CD25 in vitro. A combinação foi bem tolerada e induziu a resposta objetiva em 67 % dos 14 pacientes. Os efeitos adversos mais significantes foram aqueles já relatados com bexarotena sozinha (hipertrigliceridemia e inibição da função tireóide devido à produção de TSH aumentada) e linfopenia de grau 3 ou 4 mas resolvendo dentro de um mês de cessação da terapia. O tempo para a falha do tratamento não foi indicado neste estudo. Em outros estudos, anticorpos anti-CD4 que esgotam as células que expressam CD4 células foram desenvolvidos. Os exemplos incluem o anticorpo de zanolimumab anti-CD4 IgG1 completamente humano (HuMax-CD4; Genmab A/S e TenX BioPharma Inc.), e o anti-CD4 monoclonal quimérico (cM-T412, Centocor, Malvern, PA) foi administrado a 8 pacientes com MF e induziu a resposta objetiva em 7 destes mas com uma resposta média de duração de somente 5 meses. Uvadex® (methoxsalen, Therakos Inc. Exton, PA) na fotoforese extra corporal, também apresentou sinais de eficácia. O anticorpo monoclonal humanizado alemtuzumab (hu-IgGi anti- CD52 mAb, Campath®, Millennium Pharmaceuticals, Inc. e ILEX Oncology, Inc., comercializado e distribuído nos EUA pela Berlex Laboratories, Inc., Montville, NJ) é indicado para o tratamento da leucemia linfática crônica da célula B (B- CLL) em pacientes que foram tratados com agentes de alquilação e que falharam na terapia de fludarabina. Este foi testado em pacientes com MF/SS avançada (doença em estágio III ou IV) e levou a respostas objetivas em pelo menos metade dos casos (55 % dos 22 pacientes). Seu perfil de efeito colateral consiste principalmente de imunossupressão e reações de infusão. Umm estudo retrospectivo independente também descreveu uma toxicidade cardíaca significante em 4 dos 8 pacientes. Com reduções de longa duração observadas (tempo médio à falha do tratamento de 12 meses, varia de 5 a 32+ meses), a terapia com alemtuzumab parece ser o tratamento com a duração de resposta média mais favorável se comparado com todos os tratamentos relatados até o momento. Outros agentes que podem ser úteis incluem os anticorpos anti-CCR4 (receptor de quimiocina CC 4; CD194). Um exemplo é mogamulizumab (KW- 0761; AMG-761 ; nome comercial Poteligeo, Kyowa Hakko Kirin Ltd., Japão e Amgen, EUA), e anticorpo anti-CCR4 humanizado. Outros agentes que podem ser úteis incluem anticorpos anti-CD30. Um exemplo é SGN-35 que é um medicamente conjugado com anticorpo (ADC) contendo o medicamento antimitótico potente, monometilauristatina E (MMAE), ligado ao anticorpo monoclonal anti-CD30, cAC10 (Okeley et al. (2010) Clin. Cancer Res. 16(3): 888897); outro exemplo é o anticorpo monoclonal de Glic da imunoglobulina (Ig) anti- CD30 humano MDX-060 (Medarex Inc. And Bristol Myers Squibb; Ansell et al. (2007) J. Clin. Oncol. 25: 2767-2769). Cada um destes tratamentos podem ser usados em combinação com os anticorpos da divulgação.
[00270] Os anticorpos produzidos usando os presentes métodos são particularmente eficazes no tratamento de distúrbios autoimunes e inflamatórios, bem como distúrbios cardiovasculares mais particularmente, síndrome coronária aguda, artrite, artrite reumatóide, vasculite reumatóide, lupo eritematoso sistêmico, esclerose múltipla e granulomatulose de Wegener, espondiloartrite. Em geral, os presentes métodos podem ser usados para tratar qualquer distúrbio causado pelo menos em parte pela presença ou atividade de células que expressa, KIR3DL, por exemplo, células NK ou células T, células T ou NK pró- inflamatórias que produzem IL-17A, células T tais como células Th17 ou células CD4+CD28- que expressam KIR3DL2, e que podem, portanto, ser eficazmente tratadas exterminando-se seletivamente ou inibindo a proliferação ou ativação das células que expressam KIR3DL2.
[00271] Em algumas formas de realização, antes da administração do anticorpo anti-KIR3DL2, a expressão de KIR3DL2 nas células subjacentes ao distúrbio particular será avaliada. Isto pode ser efetuado através da obtenção de uma amostra de PBLs ou células do local do distúrbio (por exemplo, da sinóvia em pacientes com RA), e testando por exemplo, através do uso de imunoensaios, para determinar a proeminência relativa dos marcadores tais como CD4, CD28, etc., bem como KIR3DL2 nas células. Outros métodos também podem ser usados para detectar a expressão de KIR3DL2 e outros genes, tais como métodos com base em RNA, por exemplo, RT-PCR ou Northern blotting.
[00272] O tratamento pode envolver rodadas múltiplas de administração de anticorpo ou composto. Por exemplo, seguindo uma rodada inicial de administração, o nível e/ou atividade de células T ou NK que expressam KIR3DL (por exemplo, células T CD4+CD28-, células T CD4+ malignas), no paciente serão geralmente reavaliadas, e, se ainda elevado, uma rodada adicional de administração pode ser realizado. Deste modo, rodadas múltiplas de detecção de receptor e anticorpo ou administração de composto podem ser realizados, por exemplo, até o distúrbio ser mantido sob controle.
[00273] Quando usado para o tratamento de distúrbios autoimunes ou inflamatórios, os anti-anticorpos KIR3DL2 da divulgação podem ser usados para o tratamento em combinação com qualquer agente conhecido ser útil no tratamento do distúrbio inflamatório particular, distúrbio autoimune, ou distúrbio cardiovascular. Os anticorpos anti-KIR3DL2 podem ser combinados, por exemplo, com agentes esteróides anti-inflamatórios, agentes anti-inflamatórios que não esteróides, anti-metabólitos e outros agentes usados no tratamento de doenças cardiovasculares, inflamatórias ou autoimunes. Em algumas formas de realização, os agentes anti-inflamatórias compreendem agentes anti- inflamatórios esteróides, que incluem glicocorticosteróides e mineralocorticosteróides. Estes podem ser administrados através de qualquer método adequado para tratar os distúrbios inflamatórios, incluindo, entre outros, vias orais, intravenosas, intramusculares, dérmicas, ou nasais. Em algumas formas de realização, os agentes anti-inflamatórios compreendem agentes anti- inflamatórios que não esteróides. Estes agentes geralmente agem inibindo-se a ação da enzimas de cicloxigenase e lipoxigenase, ou receptores para os mediadores gerados por estas enzimas. Os compostos anti-inflamatórios que não esteróides incluem inibidores de COX não seletivos, inibidores de COX seletivos, bem antagonistas de FLAP e antagonistas de 5-lipoxigenase. Em algumas formas de realização, os agentes anti-inflamatórios podem compreender anti- metabólitos que afetam a proliferação das células envolvidas na resposta imune. Os anti-metabólitos adequados incluem análogos de foliato, tais como metotrexato; inibidores de inosina monofosfato desidrogenase (IMPDH), tal como micofenolato de mofetila; e azatiopurina. Os Compostos deste grupo geralmente afetam a produção dos substratos necessários para a replicação de DNA, deste modo inibindo a proliferação de células envolvidas ou ativadas na resposta a uma reação inflamatória. Em algumas formas de realização, o agente anti- inflamatório é um agente que bloqueia a ação do TNF-alfa, a citocina principal envolvida nos distúrbios inflamatórios. Em algumas formas de realização, o anti- TNF é um anticorpo que bloqueia a ação de TNFalfa. Um anticorpo anti-TNF exemplar é infliximab (Remicade®). Em outras formas de realização, o agente anti-TNFalfa é um construto receptor que liga TNFalfa e previne sua interação com os receptores de TNF nas presentes células, por exemplo, entanercept (Enbrel®). Em outras formas de realização, o agente anti-inflamatório é qualquer outro agente (por exemplo, um agente de anticorpo) tendo propriedades imunossupressoras e úteis no tratamento do distúrbio sendo tratado com o anticorpo KIR3DL2 aqui descrito.
Formulações farmacêuticas
[00274] Os carregadores farmaceuticamente aceitáveis que podem ser usados nestas composições incluem, mas não são limitados a, trocadores de íons, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas de soro, tais como albumina de soro humano, substâncias de tampão tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas parciais de glicerídeos de ácidos graxos vegetais saturados, água, sais ou eletrólitos, tais como sulfato de protamina, hidrogeno fosfato de dissódio, hidrogeno fosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinil pirrolidona, substâncias com base em celulose, polietileno glicol, carboximetilcelulose de sódio, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloco de polietileno-polioxipropileno, polietileno glicol e lanolina. Os anticorpos aqui descritos podem ser utilizados em um método de modulação, por exemplo, inibindo a atividade das células que expressam KIR3DL2 em um paciente. Este método compreende a etapa de comunicar a dito composição com o dito paciente. Tal método será útil tanto para profilaxia e propósitos terapêuticos.
[00275] Para o uso na administração a um paciente, a composição será formulada para a administração ao paciente. As composições aqui descritas podem ser administradas de maneira oral, parenteral, pela pulverização de inalação, de maneira tópica, retal, nasal, bucal, vaginal ou por intermédio de um reservatório implantado. As técnicas aqui usadas incluem subcutâneas, intravenosas, intramusculares, intra-articulares, intra-sinoviais, intraesternal, intratecal, intra-hepática, intralesional e injeção intracraniana ou técnicas de infusão. O anticorpo pode estas presente em uma dose única em uma quantidade, por exemplo, de entre cerca de 25 mg e 500 mg.
[00276] As formas injetáveis estéreis das composições aqui descritas podem ser aquosas ou uma suspensão oleaginosa. Estas suspensões podem ser formuladas de acordo com as práticas conhecidas na técnica usando agentes de dispersão ou umectação adequados e agentes de suspensão. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetável estéril em um diluente ou solvente não tóxico do ponto de vista parenteral, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes adequados que podem ser utilizados são água, solução de Ringer e solução isotônica de cloreto de sódio. Além disso, os óleos estéreis fixos são convencionalmente utilizados como um solvente ou meio de suspensão. Para este propósito, qualquer óleo fixo brando pode ser utilizado incluindo mono- ou di-glicerídeos sintéticos. Os ácidos graxos, tais como ácido oléico e seus derivados de glicerídeo são úteis na preparação de injetáveis, como são óleos naturais farmaceuticamente aceitáveis, tais como óleo de oliveira ou óleo de mamona, especialmente nas suas versões polioxetiladas. Estas soluções ou suspensões oleosas também podem conter um diluente ou dispersante de álcool de cadeia longa, tal como carboximetil celulose ou agentes de dispersão similar que são comumente usados na formulação de formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis incluindo emulsões e suspensões. Outros tensoativos comumente usados, tais como Tweens, Spans e outros agentes de emulsificação ou intensificadores de biodisponibilidade que são comumente usados na fabricação de formas de dosagem sólidas, líquidas, ou outras formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis ou outras formas de dosagem também podem ser usadas para os propósitos da formulação.
[00277] As composições aqui descritas podem ser oralmente administradas em qualquer forma de dosagem oralmente aceitável incluindo, mas não limitando a, cápsulas, tabletes, suspensões ou soluções aquosas. No caso de tabletes para o uso oral, os carregadores comumente usados incluem lactose e amido de milho. Agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, também são tipicamente adicionados. Para a administração oral em uma forma de cápsula, os diluentes úteis incluem, por exemplo, lactose. Quando as suspensões aquosas são necessárias para o uso oral, o ingrediente ativo é combinado com agentes de emulsificação e suspensão. Se desejado, alguns agentes de adoçamento, agentes de sabor ou agentes de coloração também podem ser adicionados.
[00278] Alternativamente, as composições aqui descritas podem ser administradas na forma de supositórios para a administração retal. Estas podem ser preparadas misturando-se o agente com um excipiente não irritante adequado que é sólido na temperatura ambiente mas líquido na temperatura retal, e portanto, fundirão no reto para liberar o medicamento. Tais materiais incluem manteiga de cacau, cera de abelhas e polietileno glicóis.
[00279] As composições aqui descritas também podem ser administradas topicamente, especialmente quando o alvo do tratamento inclui áreas ou órgãos prontamente acessíveis pela aplicação tópica, incluindo doenças do olho, da pele, ou o trato intestinal inferior. As formulações tópicas adequadas são prontamente preparadas para cada uma destas áreas ou órgãos. Para as aplicações tópicas, as composições podem ser formuladas em um unguento adequado contendo o componente ativo em suspensão ou dissolvido em um ou mais carregadores. Os carregadores para a administração tópica dos compostos aqui descritos incluem, mas não são limitados a, óleo mineral, vaselina líquido, vaselina branca, propileno glicol, polioxietileno, composto de polioxipropileno, cera emulsificadora e água. Alternativamente, as composições podem ser formuladas em uma loção ou creme adequados contendo os componentes ativos colocados em suspensão ou dissolvidos em um ou mais carregadores farmaceuticamente aceitáveis. Os carregadores adequados incluem, mas não são limitados a, óleo mineral, monoestearato de sorbitano, polissorbato 60, cera de ésteres cetílicos, álcool cetearílico, 2-octildodecanol, álcool benzílico e água.
[00280] Os presentes anticorpos podem ser incluídos em kits. Os kits podem opcionalmente conter qualquer número de anticorpos e/ou outros compostos, por exemplo, 1, 2, 3, 4, ou qualquer outro número de anticorpos e/ou compostos terapêuticos. Será apreciado que esta descrição dos conteúdos dos kits não é limitante de qualquer forma. Por exemplo, o kit pode conter outros tipos de compostos terapêuticos. Preferivelmente, os kits também incluem instruções para usar os anticorpos, por exemplo, detalhando os métodos aqui descritos.
Formas de Dosagem
[00281] As formulações terapêuticas dos anticorpos são preparadas para o armazenamento misturando-se os anticorpos tendo o grau desejado de pureza com carregadores, excipientes, ou estabilizadores opcionais farmaceuticamente aceitáveis, na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Para informação geral com relação Às formulações, ver, por exemplo, Gilman et al. (eds.), The Pharmacological Bases of Therapeutics, 8a Ed. (Pergamon Press, 1990); Gennaro (ed.), Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a Edição (Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1990); Avis et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Drugs (Dekker, Nova Iorque, 1993); Lieberman et al. (eds.), Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets (Dekker, Nova Iorque, 1990); Lieberman et al. (eds.) Pharmaceutical Dosage Forms: Disperse Systems (Dekker, Nova Iorque, 1990); e Walters (ed.), Dermatological and Transdermal Formulations (Drugs and the Pharmaceutical Sciences), Vol 119 (Dekker, Nova Iorque, 2002).(a) Os carregadores, excipientes, ou estabilizadores aceitáveis são não tóxicos aos recipientes nas dosagens e concentrações utilizadas, e incluem tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo ácido ascórbico e metionina; conservantes (tais como cloreto de octadecildimetilbenzil amônio; cloreto de hexametônio; cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio; fenol, butil ou álcool benzílico; alquil parabenos tais como metil ou propil parabeno; catecol; resorcinol; cicloexanol; 3-pentanol; e m-cresol); polipeptídeos de baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos); proteínas tais como albumina de soro, gelatina, ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona; aminoácidos tais como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, ou lisina; monossacarídeos, dissacarídeos, e outros carboidratos incluindo glicose, manose, ou dextrinas; agentes quelantes tais como ácido etilenodiaminotetracético (EDTA); açúcares tais como sacarose, manitol, trealose, ou sorbitol; contra-íons formadores de sal tais como sódio; complexos metálicos (por exemplo, complexos de proteína de Zn); e/ou tensoativos não iônicos tais como TWEENTM, PLURONICSTM, ou PEG.
[00282] As formulações de anticorpos exemplares são descritas, por exemplo, na WO 1998/56418, que descreve uma formulação líquida de doses múltiplas para um anticorpo anti-CD20, que compreende 40 mg/ml de rituximab, 25 mm de acetato, 150 mm de trealose, 0,9 % de álcool benzílico, e 0,02 % de polissorbato20 no pH 5,0 que tem uma vida de prateleira de armazenamento mínima de dois anos de 2 a 8° C. Outra formulação anti-CD20 de interesse compreende 10 mg/ml de rituximab em 9,0 mg/ml de cloreto de sódio, 7,35 mg/mL de citrato de sódio diidratado, 0,7 mg/ml de polissorbato80, e água estéril para injeção, pH 6,5.
[00283] As formulações liofilizadas adaptadas para a administração subcutânea são descritas, por exemplo, na Pat. U.S. No. 6.267.958 (Andya et al.). Tais formulações liofilizadas podem ser reconstituídas com um diluente adequado até uma alta concentração de proteína e a formulação reconstituída pode ser administrada subcutaneamente ao mamífero a ser aqui tratado.
[00284] A formulação aqui descrita também pode conter mais do que um composto ativo (um segundo medicamento como indicado acima), preferivelmente aqueles com atividades complementares não afetam adversamente uns aos outros. O tipo e quantidade eficazes de tais medicamentos dependem, por exemplo, da quantidade e tipo de antagonista de célula B presente na formulação, e os parâmetros clínicos dos indivíduos. Os segundos medicamentos exemplares são indicados acima.
[00285] Os ingredientes ativos também podem estar contidos em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de coacervação ou através da polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas de gelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacialato), respectivamente, nos sistemas de liberação de medicamentos coloidais (por exemplo, lipossomos, microesferas de albumina, microemulsões, nano- partículas, e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em Remington's Pharmaceutical Sciences, acima, por exemplo.
[00286] As Formulações de liberação sustentada podem ser preparadas. Os exemplos adequados de preparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o antagonista, cujas matrizes estão na forma de artigos formados, por exemplo, películas, ou microcápsulas. Os exemplos de matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli(álcool vinílico)), polilactídeos (Pat. U.S. N. 3.773.919), copolímeros do ácido L- glutâmico e etil-L-glutamato, acetato de etileno-vinila não degradável, copolímeros de ácido lático-ácido glicólico degradáveis tais como o Lupron Depot (microesferas injetáveis compostas de copolímero de ácido lático-ácido glicólico e acetato de leuprolida), e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico.
[00287] As formulações a ser usadas na administração in vivo devem ser estéreis. Isto é prontamente efetuado através de membranas de filtração estéreis. Os carregadores farmaceuticamente aceitáveis que podem ser usados nestas composições incluem, mas não são limitados a, trocadores de íons, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas de soro, tais como albumina de soro humano, substâncias de tampão tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas parciais de glicerídeos de ácidos graxos vegetais saturados, água, sais ou eletrólitos, tais como sulfato de protamina, hidrogeno fosfato de dissódio, hidrogeno fosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinil pirrolidona, substâncias com base em celulose, polietileno glicol, carboximetilcelulose de sódio, poliacrilatos, ceras, copolímeros de bloco de polietileno-polioxipropileno-polietileno glicol e lanolina.
[00288] Outros aspectos e vantagens serão divulgados na seguinte seção experimental, que deve ser considerada como ilustrativa e não limitante do escopo deste pedido.
EXEMPLOS
[00289] Exemplo 1 - Geração de anticorpos anti-KIR3DL2
[00290] Materiais e métodos
[00291] Triagens pela citometria de fluxo primária e secundária
[00292] Anti-KIR3DL2 mAbs foram primeiramente triados na citometria de fluxo para a ligação às linhagens de células Sezary que expressam KIR3DL2 (HUT78 e COU-L) e Às linhagens de células tumorais transfectadas em KIR3DL2 (HEK- 293T). Os dispositivos de citometria de fluxo incluem: FACSarray (BD Biosciences, triagem primária), FACSCanto II n°1 e n°2 (BD Biosciences) (triagens secundárias) e FC500 (Beckman Coulter) (triagens secundárias). O KIR3DL2+ e outras linhagens de células tumorais usadas incluem:
[00293] - HUT-78 (Linhagem de células Sezary KIR3DL2 positivas )crescimento em IMDM completo;
[00294] - HEK-293T (câncer de rim humano)/KIR3DL2 e HEK- 293T/KIR3DL2 Domínio 0 - linhagens de células eGFP (crescimento em DMEM completo);
[00295] - COU-L (Linhagem de células Sezary KIR3DL2 positivas) (crescimento em RPMI completo complementado com soro humano AB a 10 %);
[00296] - HEK-293T/KIR3DL1 e HEK-293T/KIR3DL1 —linhagens de células eGFP (crescimento em DMEM completo);
[00297] - B221 (B-linfoblastóide, linhagem de células humanas CD20 positiva)/linhagem de células KIR3DL2 (crescimento em RPMI completo contendo soro FCS); e
[00298] - RAJI (linhagem de células de Burkitt CD20 humanas positiva)/ linhagem de células KIR3DL2 (crescimento em RPMI completo contendo soro FCS).
[00299] Considerando que nenhuma das linhagens de células Sezary usadas crescem depois da transferência de IV ou SC ao camundongo imune comprometido, as células B221 ou RAJI transfectadas em KIR3DL2 crescem como tumores disseminados (IV) ou sólidos (SC) depois da injeção ao camundongo.
[00300] Com base na informação disponível em Gardiner et al, Journal of Immunology 2001 (vol 166, p2992-3001), os alelos de gene KIR3DL2 presentes nas linhagens de células tumorais usados foram determinados. Estabelecemos que a linhagem de células Sezary COU-L é um heterozigoto para os alelos 3DL2*003 e 3DL2*008 e HUT-78 é alelo de heterozigoto 3DL2*002 e 3DL2*007. Todos os 4 alelos 3DL2*003, 3DL2*008, 3DL2*002 e 3DL2*007 codificam as variantes proteicas de KIR3DL2 carregando diferenças nos seus domínios extracelulares domínios. De nota, a proteína de fusão KIR3DL2-Fc combinante que foi usada para imunizar o camundongo é codificada por diferentes alelos de gene KIR3DL2 3DL2*006 e 3DL2*007 (clone 1,1, ambos alelos codificando a mesma sequência de proteína de domínio extracelular).
[00301] Linhagens de células dos domínios KIR3DL2 0, 1 e 2
[00302] As células HEK293T/17 foram cultivadas em DMEM (Gibco) suplementadas com piruvato de sódio (1 mM), penicilina (100 μ/ml), estreptomicina (100 μg/ml) e 10 % de FCS inativado por calor (PAN biotech). o reagente Lipofectamina 2000, Trizol, SuperScript II de Transcriptase reversa, vetor pcDNA3,1 e anticorpos anti-V5-FITC foram adquiridos da Invitrogen. (H+L)- PE anti-camundongo de cabra foi adquirido da Beckman Coulter. PBMC (células 5 x 106) de Homo Sapiens foram recolocadas em suspensão em 1 ml de reagente de Trizol. A extração do RNA foi realizada adicionando-se 200 ml de clorofórmio. Depois da centrifugação (15 min, 13.000 rpm), o RNA foi precipitado da fase aquosa com 500 μl de isopropanol. Depois da incubação (10 min, RT) e centrifugação (10 min, 13.000), o RNA foi lavado com 70 % de etanol e recentrifugada (5 min, 13,000 rpm). O RNA foi recolocado em suspensão em água isenta de Rnase de H2O. O cDNA foi obtido usando Transcriptase reversa SuperScript II usando 2 μg de RNA específico e seguindo as instruções do fabricante. As sequências KIR3DL2 humano (número de acesso U30272, KIR3DL2 alelo *002) domínio 0, domínio 1 e domínio 2 são mostradas na Tabela 4.
[00303] Tabela 4
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[00304] As sequências de KIR3DL2 de Homo Sapiens (número de acesso U30272) domínio 0, domínio 1 e domínio 2 sequências foram amplificadas pela reação PCR do cDNA usando os oligonucleotídeos 5' AA GCT AGC GGT AAG CCT ATC CCT AAC CCT CTC CTC GGT CTC GAT TCT ACG CTC ATG GGT GGT CAG GAC AAA C (SEQ ID NO: 71) (avançado) e 3' AA GGA TCC CTC TCC TGA TTT CAG CAG GGT (SEQ ID NO: 72) (reverso); 5' AA GCT AGC GGT AAG CCT ATC CCT AAC CCT CTC CTC GGT CTC GAT TCT ACG ACA GTC ATC CTG CAA TGT TGG (SEQ ID NO: 73) (avançado) e 3' AA GGA TCC CTC TCC TGC CTG AAC CGT GGG (SEQ ID NO: 74) (reverso) ; 5' AA GCT AGC GGT AAG CCT ATC CCT AAC CCT CTC CTC GGT CTC GAT TCT ACG AAC GTG ACC TTG TCC TGT AGC (SEQ ID NO: 75) (avançado) e 3' AA GGA TCC ATG CAG GTG TCT GCA GAT ACC (SEQ ID NO: 76) (reverso) respectivamente. Depois da clonagem e sequenciamento de TA, as sequências foram clonadas em pcDNA3,1 vetor entre os sítios de restrição NheI e BamHI. Estes construtos foram inseridos entre o condutos peptídico CD33 e o DNA âncora GPI CD24 (o GPI CD24 e sequências de aminoácidos são mostradas na SEQ ID NOS: 77 e 78, respectivamente) sintetizados por MWG Biotech (inseridos entre os sítios de restrição BamHI e HindIll).
[00305] As células HEK-293T/17 foram semeadas 24 horas antes da transfecção em 6 placas de reservatório (5.105 células/reservatório) em DMEM sem antibióticos. As transfecções foram realizadas usando 5 μg dos construtos de domínios pcDNA3,1/KIR3DL2 0, pcDNA3,1/KIR3DL2 domínio 1 ou pcDNA3,1/KIR3DL2 domínio 2 diferentes usando Lipofectamina 2000 de acordo com as instruções do fabricante. para garantir a pureza do DNA para a transfecção, o kit isento de endotoxina Maxi-prep da Qiagen foi usado. A razão de Lipofectamina/DNA usada foi fixada em 2/1. As células foram colhidas 48 horas depois da transfecção para os experimentos de citometria de fluxo.
[00306] Imunização
[00307] Os camundongos foram imunizados com proteína de fusão de KIR3DL2-Fc recombinante (alelo *006). O sobrenadante (SN) dos hibridomas de crescimento foram testados pela citometria de fluxo em HUT78 , COU-L e HEK- 293T/KIR3DL2 Domínio 0 - eGFP. Os hibridomas potencialmente interessantes selecionados a partir da triagem inicial foram clonados limitando-se as técnicas de diluição em placas de 96 reservatórios. As triagens secundárias envolveram a seleção de hibridomas de interesse testando os sobrenadantes dos subclones pela citometria de fluxo em HUT78, COU-L, HEK-293T/KIR3DL1 Domínio 0 - eGFP e HEK-293T/KIR3DL2 Domínio 0 - eGFP. Os subclones positivos foram injetados nos camundongos para produzir ascite e os anticorpos de interesse foram purificados antes de ser testados em um ensaio de Biacore usando chips KIR3DL2 rec, seguido por vários formatos de ensaio com base na ligação às células humanas que expressam KIR3DL2. Entre os clones selecionados, estavam os sobrenadantes para anticorpos 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 4B5, 5H1, 1E2, 1C3 e 20E9. Com base na triagem que permitiram a seleção entre a ligação de domínio D0 ou D1/2, os anticorpos 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 4B5, 5H1 e 1E2 ligam ao KIR3DL2 presentes no domínio extracelular 0 (D0) enquanto 1C3 e 20E9 ligam a um epítopo presente no domínio 1/2 (D2).
[00308] As sequências dos domínios variáveis de cadeia pesada (VH) e (VL) leve dos anticorpos selecionados foram amplificados por PCR a partir do cDNA de cada anticorpo. As sequências amplificadas foram operadas em gel de agarose e então purificadas usando o kit de Extração em Gel Qiagen. As sequências de VH e VL foram depois subclonadas nos vetores de expressão Lonza (Vetores de Duplo Gene) usando o sistema de InFusion (Clontech) de acordo com as instruções do fabricante. Depois do sequenciamento, os vetores contendo as sequências de VH e VL foram preparadas como Maxiprep usando o Sistema Maxiprep Plasmídeo Promega PureYield®. Os vetores foram depois usados para a transfecção da célula HEK-293T usando Lipofectamina 2000 da Invitrogen de acordo com as instruções do fabricante.
[00309] Exemplo 2 - Anticorpos que não induzem a internalização de KIR3DL2
[00310] Resumidamente, no anticorpo ou 20 kg/ml de um anticorpo de domínio anti-KIR3DL2 0, ou anticorpo 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 4B5, 5H1, 1E2, 1C3 ou 20E9 foram incubados com células de Síndrome de Sezary frescas de 5 doadores humanos diferentes, por 24 horas a 37° C. As células foram depois lavadas, fixas e permeabilizadas usando um reagente de permeabilização IntraPrep da Beckman Coulter. A presença de 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 4B5, 5H1, 1E2, 1C3 ou 20E9 Ab que ligam KIR3DL2 é revelada com um Ab de cabra anti-camundongo, rotulado com GAM-PE. A Tabela 6 mostra um exemplo de um anticorpo 13H1 de domínio anti-KIR3DL2 0, depois de 24 horas de incubação, respectivamente. A Tabela 5 mostra uma diminuição intensa na fluorescência para 13H1 em cada um dos diferentes doadores, confirmando que a ligação deste anticorpo infra-modula a expressão de KIR3DL2 nas células SS. Resultados similares foram obtidos para o anticorpo 4B5 anti-D0 bem como uma faixa de anticorpos anti-D1. Inversamente, os anticorpos 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 5H1, 1E2, 1C3 e 20E9 anti-KIR3DL2 de domínio 0 ou domínio 2 não resultaram em uma diminuição na fluorescência indicando que este anticorpo não infra-modula a expressão de KIR3DL2 nas células SS. A Tabela 6 mostra um exemplo representativo para o anticorpo 10G5.Tabela 5
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[00311] Exemplo 3 - Anticorpos que não internalizam na linhagem de células da síndrome de Sezary
[00312] A internalização dos anticorpos 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 13H1, 4B5, 5H1, 1E2, 1C3 e 20E9, bem como do anticorpo AZ158 (um anti-domínio 0 mAb) e outros anticorpos anti-D1 foi avaliada através da microscopia de flúor usando a linhagem de células HUT78 SS.
[00313] Materiais e Métodos:
[00314] As células Hut-78 foram incubadas durante 1 hora a 4° C com 10 μg/ml dos anticorpos diferentes. Depois desta incubação, as células foram fixadas (t = OH) ou incubadas por 2 horas a 37° C. As células incubadas por 2 horas foram depois fixadas e tingidas. Os anticorpos foram tingidos usando anticorpos de cabra anti-camundongo ligados a Alexa594 (Invitrogen, A11032). Os compartimentos de LAMP-1 foram tingidos usando anticorpos de coelho antiLAMP-1 (Abeam, ab24170) revelados por anticorpos policlonais de cabra anticoelho ligados a FITC (Abeam ab6717). Imagens foram adquiridas usando um dispositivo Apotome (Zeiss) e analisadas usando o suporte lógico Axiovision.
[00315] Resultados:
[00316] As mAbs Anti-KIR3DL2 foram visíveis em vermelho enquanto os compartimentos LAMP-1 foram visíveis em verde. Na hora da adição dos anticorpos, o tingimento de KIR3DL2 em vermelho foi visível na superfície da célula, enquanto LAMP-1 verde foi visível intracelularmente em verde. Contudo, em 2 horas após a adição dos anticorpos, cada um dos anticorpos AZ158, 13H1 e 4B5, e anti-D1 anticorpos causaram uma mancha vermelha a ser co-localizada com mancha verde, junto com uma diminuição na mancha vermelha na superfície celular, indicando que os anticorpos AZ158, 13H1 e 4B5, e anti-D1 foram rapidamente internalizados. Os anticorpos 10F6, 2B12, 18C6, 9E10, 10G5, 5H1, 1E2, 1C3 e 20E9, contudo não foram internalizados, e em 2 horas após a adição do anticorpo, a mancha vermelha permaneceu totalmente na superfície celular.
[00317] Exemplo 4 -Anticorpos que são capazes de exterminar os alvos que expressam KIR3DL2 por intermédio do mecanismos dependente de complemento (CDC)
[00318] Resumidamente, 50 μl de 20 μg/ml de anticorpos (2 x concentrados) diluídos foram fornecidos em um meio padrão em reservatórios P96 de fundo branco translúcido (Ref 655098 - Greiner), aos quais foram adicionados 50 μl de uma suspensão celular a 2 milhões por ml (100.000 células por reservatório) em um meio padrão, e incubados por 30 minutos a 4° C. 5 μl por reservatório de complemento recentemente reconstituído (Ref CL3441 - Cedarlan) foram adicionados, seguido pela incubação de 1 hora a 37° C. 100 μl por reservatório da Célula Titer Glo (Ref G7572 - Promega) foram adicionados seguido pela incubação de 10 minutos na temperatura ambiente protegidos da luz. Os resultados foram lidos usando um luminômetro (VICTOR).
[00319] Usando complemento purificado do sangue de coelho, a capacidade de nosso mAbs anti-KIR3DL2 de recrutar complemento e células B221 transfectadas em KIR3DL2 por lise foi avaliada in vitro.
[00320] A Figura 6 mostra a capacidade dos anticorpos de mediar CDC; mAbs anti-KIR3DL2 que ligam ao domínio D0 estão em cinza, aqueles que ligam ao domínio D1 estão em preto. Com o mAbs de murino precursores, no isótipo de mAb tem a maioria da influência proeminente no resultado deste ensaio conforme os mAbs de murino IgG2b ligam ao complemento de maneira mais eficiente que qualquer outro tipo de isótipo (o IgG1 de camundongo não liga ao complemento).
[00321] Para resolver o impacto na morte da célula alvo mediada pelo complemento da internalização de KIR3DL2 na ligação com mAbs anti-KIR3DL2, usamos mol9H12, um anticorpo anti-KIR3DL2 que induz a internalização rápida do KIR3DL2 em linhagem de células de Sezary HUT78 e B221-KIR3DL2. Antes da incubação com o complemento, nós pré-incubamos os alvos B221-KIR3DL2 com mol9H12 ou 4° C (a internalização é bloqueada) ou 37° C (que permite a internalização ótima). então, o complemento foi adicionado, incubado e o CDC medido como acima.
[00322] Neste experimento, a internalização do KIR3DL2 na ligação anula totalmente a capacidade de mo19H12 exterminar B221-KIR3DL2 com recrutamento de complemento, considerando que nas condições de temperatura que limitam a internalização, a atividade de CDC de mo19H12 é claramente observada (Figura 7). O rituximab Anti-CD20 é usado como um controle que media CDC contra os alvos CD20+ mas não induzem a internalização CD20.
[00323] Os mAbs selecionados foram quimerizados em IgG1 humano para torná-los capazes de mediar as funções efetoras (ADCC e CDC). A Figura 8 mostra a capacidade do mAbs anti-KIR3DL2 quimérico de mediar CDC contra B221-KIR3DL2 in vitro.
[00324] Alguns clones mAb como 1E2 e 10G5, depois da quimerização, adquiriram a capacidade de exterminar os alvos KIR3DL2 positivos através de um mecanismo CDC. Neste experimento, para o mAbs anti-D0, a internalização potente (tal como aquela induzida por 13H1, em preto), pode prevenir a eficácia ótima como observado para 1E2 e 10G5 em particular.
[00325] Exemplo 5 - Anticorpos capazes de exterminar alvos que expressam KIR3DL2 por intermédio da citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC)
[00326] A lise celular através de um mecanismo de ADCC monitorada em um experimento de liberação de 51Cr com base em radioatividade (o nível de radioatividade liberada das células alvos pré-carregadas sendo proporcionais à sua morte). Um milhão de células alvo foram carregadas com 51Cr por 1 hora a 37° C e lavadas 3 vezes. 3.000 células foram semeadas por reservatório (placas de 96 reservatórios em forma de U) e mAbs de teste são adicionados a 10 ou 20 μg/ml de concentração final (ou concentrações crescentes se a relação de resposta de dosagem é estudada). As células efetoras foram adicionadas em uma razão definida de efetor:alvo (em general 10:1) e a mistura foi incubada a 37° C por 4 h. O sobrenadante é analisado em um dispositivo Lumaplate. Quando os mAbs huIgG1 quiméricos são usados, as células efetoras foram células NK humanas halogênicas purificadas a partir de PBMCs retiradas de doador voluntário saudável.
[00327] Para a avaliação ótima, os experimentos de ADCC foram geralmente realizados usando mAbs huIgG1 quimerizados gerados a partir de vários mAbs anti-KIR3DL2 de murino parenterais. A Figura 9 mostra a capacidade de uma série de mAbs anti-KIR3DL2, testados nas mesmas concentrações finais (10 μg/ml), para exterminar a linhagem de células HUT78 de Sezary prototípicas através de um mecanismo mediado por ADCC.
[00328] A Figura 10 mostra um experimento similar em que as células alvos usadas são B221 transfectados em KIR3DL2 que são, em geral, mais sensíveis ao extermínio mediado por ADCC pelo mAbs anti-KIR3DL2. O mAbs mostrado em cinza induz a internalização do receptor e parece ser menos eficaz do que os outros 4 mAbs que não induzem a internalização de KIR3DL2.
[00329] A Figura 11 mostra uma comparação dos anticorpos em um experimento de dose variante da capacidade do mAbs huIgG1 anti-KIR3DL2 quimerizado de mediar ADCC contra os alvos B221 que expressam KIR3DL2, o perfil de eficácia de mAbs que não induzem a internalização do alvo (10F6, 2B12 e 10G5) é melhor do que aquela da internalização de KIR3DL2 que induz mAbs (13H1 e mAbs anti-D0 15C11 e 18B10).
[00330] Exemplo 6 — Atividade em modelos de xenoenxereto de tumores humanos que expressam KIR3DL2
[00331] Materiais e métodos
[00332] Os camundongos imuno comprometidos usados para os modelos B221-KIR3DL2 e RAJI-KIR3DL2 foram NOD-SCID adquirido da Charles River Laboratories. Nos seguintes modelos, 5 milhões de células tumorais humanas (em 100 μl de PBS como veículo) foram enxertados IV no Dia 0 (D0), isto é, 1 dia antes do início do tratamento (D1). A partir de D1, os camundongos foram tratados IV com diferentes doses de mAbs (as doses foram adaptadas ao peso do corpo do camundongo) diluídas em PBS, 2 injeções por semana pela duração duração do experimento total.
[00333] Os grupos de controle incluíram, dependendo do experimento:
[00334] - camundongos tratados com PBS/placebo como um controle do crescimento tumoral normal/não afetado;
[00335] - camundongos injetados com a mesma dose de mabs igualados no controle direcionados contra um antígeno irrelevante.
[00336] Os camundongos foram pesados e observados quanto sinais clínicos a cada 2 a 5 dias dependendo do modelo. A porcentagem das mudanças no peso corporal foram calculadas como comparado ao peso do corpo do D0 antes do enxerto do tumor ou ao peso corporal mais alto atingido durante o experimento. As mortes dos camundongos ou perdas de peso importantes foram registradas e usadas para desenhar as curvas de sobrevivência de Kaplan-Meier e calcular a melhora na sobrevivência se comparado aos grupos de controle dos camundongos.
[00337] Resultados
[00338] A Figura 12 mostra os resultados de um experimento (n = 6 de camundongos NOD-SCID por grupo) em que a eficácia de 3 isótipos de IgG2b anti-KIR3DL2 9E10 e 19H12 de murino (ambos dados a 300 μg/camundongo, duas vezes por semana) foi testada contra xenoenxertos de B221-KIR3DL2 SC. O anticorpo 9E10 anti-D0 não internalizante mostrou uma sobrevivência aumentada se comparado tanto a PBS quanto ao anticorpo 19H12anti-D1/D2 de internalização.
[00339] A Figura 13 mostra o resultado de outro experimento (n = 6 camundongos NOD-SCID por grupo) em que a eficácia do 19H12 anti-KIR3DL2 de murino (dado a 300 μg/camundongo, duas vezes por semana) foi testada contra xenoenxertos de RAJI-KIR3DL2 SC. In vitro, as Células RAJI transfectadas em KIR3DL2 mostraram menos internalização na ligação de mAb do que B221-KIR3DL2 ou linhagens de células de Sezary. No modelo de xenoenxerto de RAJI-KIR3DL2, mAb mol9H12 foi mais eficaz do que no modelo B221-KIR3DL2. Isto é devido a internalização menos potente do alvo in vivo.
[00340] Exemplo 7 - Bloqueio de Ligando
[00341] Materiais e métodos
[00342] Inibição de Anticorpo de Tingimento de Tetrâmero
[00343] O dímero B27 e HLA-A3 e o tingimento de FACS foram descritos previamente (Kollnberger, et al. (2007) Eur J Immunol 37:1313-1322). Os tetrâmeros HLA-A3 foram preparados com as células Baf3 de experimentos de inibição do anticorpo For transduzidas com KIR3DL2 foram tingidos com anticorpo Slag ou controle de isótipo IgGl/IgG2a (Biolegend UK Ltd) a 4°C por 20 minutos antes de tingir com tetrâmero na temperatura ambiente por 20 minutos. As células tingidas foram depois lavadas e fixadas como descrito previamente antes da análise de FACS em uma máquina de FACS BD Fortessa. A análise de FACS foi realizada usando um suporte lógico Flowjo (Tree star Inc US).
[00344] Anticorpo de células Jukart repórter de KIR3DL2 CD3s
[00345] As células repórter Jurkat tranduzidas para expressar a proteína de fusão KIR3DL2CD3E foram previamente descritas (Payeli, et al. (2012) Artrite Rheum.). para os experimentos de inibição de anticorpo as células repórter de 100.000/reservatório em RPM1640 (Sigma, suplementada com 10 % de FCS e penicilina e estreptomicina) foram primeiro tingidas a 4°C com 10 μl de anticorpo ou anticorpo de controle de isótipo por 20 minutos. Subsequentemente as células repórter foram estimuladas com 200.000 células LCL.LBL,721,221 precursoras (em seguida indicadas como 221 células) ou 221 células transfectadas com HLA- B27 ou HLA classe 1 de controle em um volume final de 200 μl. Os sobrenadantes foram colhidos depois do estímulo durante a noite para o ensaio IL-2 por ELISA (Ebiosciences UK Ltd) realizado de acordo com as instruções do fabricante.
[00346] Resultados
[00347] Os anticorpos específicos do domínio D0 inibem o tingimento do tetrâmero HLA-A3 e B27dimer (B272) das células tranduzidas de KIR3DL2
[00348] Primeiro, nós estudamos a capacidade dos anticorpos D0 e D1/D2 específicos do domínio anti-KIR3DL2 para inibir o tingimento do tetrâmero dimérico HLA-A3 e B27 de KIR3DL2. Os anticorpos 1E2 e 13H1 de anti-KIR3DL2 específicos do domínio D0 inibiram de maneira consistente o tingimento de cadeia pesada de HLA-A3 e B27 (B272) das células Baf3 transduzidas por KIR3DL2 (Figuras 14 e 16A). B272 inibiu 2B12 enquanto demonstrando efeitos negligenciáveis no tingimento do tetrâmero de HLA-A3 do KIR3DL2. Ao contrário, o 10G5 não inibiu o tingimento de KIR3DL2 com HLA-A3 ou tetrâmeros B272.
[00349] O anticorpo 1C3 específico do domínio D2 inibe HLA-A3 mas não o tingimento do dímero B27 (B272) de KIR3DL2
[00350] O anticorpo 1C3 específico de D2 inibiu de maneira consistente o tingimento do tetrâmero HLA-A3 das células transduzidas de KIR3DL2 (Figura 15 e 16B). Ao contrário MAb 1C3 não afeta o tingimento de B272 das células Baf3 de KIR3DL2 e os anticorpos específicos de D1 não afetam significantemente o tingimento de tetrâmero de HLA-A3 e B272 de KIR3DL2 (Figura 15 e 16B).
[00351] MAbs anti-KIR3DL2 específicos de D0 mas não de D1/D2 inibem as interações da repórter célula KIR3DL2 com HLA classe 1.
[00352] Determinamos o efeito dos compostos específicos de anticorpos KIR3DL2 no reconhecimento de KIR3DL2 de HLA-B27 e outro HLA classe 1 estudando o efeito dos o efeito de anticorpos sobre a produção por IL-2 de células repórter Jurkat transduzidas com KIR3DL2CD3E estimuladas com 221 transfectantes. De acordo com nossas descobertas anteriores, 221 células que expressam HLA-B27 estimularam de maneira consistente uma produção de IL-2 seis vezes maior pelas células repórter KIR3DL2 se comparada ao estímulo com as células que expressam o HLA classe 1 de controle (Figura 17).
[00353] Os anticorpos 2B12, 1E2, 10G5 e 13H1 do domínio específico D0 todos inibiram a produção IL-2 pelas células repórter KIR3DL2 estimuladas com células transfectadas HLA-B27 até algum grau (Figura 4) com 2B12 e 1E2 demonstrando os maiores efeitos inibidores. Ao contrário, o anticorpo 1C3 específico de D2 não teve efeito significante no reconhecimento da célula repórter de HLA-B27.
[00354] Os anticorpos do domínio específico D0 também inibiram a produção de IL-2 pelas células repórter KIR3DL2 estimuladas com 221 células transfectadas com HLA-B7, HLA-B35 e HLA-A2 e HLA-A3, embora os efeitos fossem menos marcantes do que aqueles observados quando as células foram estimuladas com HLA-B27. Ao contrário, o anticorpo 1C3 específico de D2 não teve efeito significante na produção de IL-2 pelas células repórter KIR3DL2 estimuladas com 221 células transfectadas com HLA-B7, HLA-B35 e HLA-A2 e HLA-A3.
[00355] Sumário
[00356] Aqui nós mostramos que os anticorpos monoclonais contra o domínio D0 de KIR3DL2 (2B12, 1E2, 13H1) inibem a ligação a (dímeros de cadeia pesada B27 isento de 32m (B272) e (ligandos associados com 32m tais como HLA-A3. Ao contrário, os anticorpos contra o domínio D2 de KIR3DL2 (1C3) inibem apenas as interações com HLA-A3 e possuem pouco efeito na ligação de tetrâmero B272.
[00357] Embora as células T repórter de KIR3DL2 produzem IL-2 quando estimuladas com HLA-B27, HLA-B7, HLA-B35, HLA-A2 e HLA-A3 e células B transfectadas com LBL,721,221, as células repórter produzem de maneira consistente 6 vezes mais IL-2 em resposta ao HLA-B27. As interações de KIR3DL2 com as células B que expressam HLA-B27 e outro HLA classe 1 são consistentemente inibidas com os anticorpos 2B12 e 1E2 do domínio específico D0 e 13H1em um grau menor. Isto sugere que o domínio D0 de KIR3DL2 pode ter alguma afinidade quanto as características comuns compartilhadas de diferentes HLA classe 1. O domínio D0 de KIR3DL2 pode ligar pelo menos em parte a um região em HLA-B27 que este é compartilhado entre diferentes HLA classe 1. A avidez aumentada de KIR3DL2 para HLA-B27 pode resultar da dimerização de cadeia pesadas de B27.
[00358] Foi indicado que os três domínios semelhantes a imunoglobulina D0, D1 e D2 de KIR3DL2 estão envolvidos no ligando de ligação. Os resultados dos estudos de inibição do anticorpo sugerem que o contato dominante de KIR3DL2 com HLA classe 1 é por intermédio do domínio D0. Notavelmente, o anticorpo 1C3 de D2 somente inibiu a ligação de HLA-A3 para KIR3DL2 e não ao dímero de B27. Portanto, nós propomos que o domínio D0 comunica os resíduos que são conservados entre diferentes HLA classe 1 e os domínios D1 e D2 comunicam as regiões polimórficas de peptídeo no complexo MHC de peptídeos. Os anticorpos identificados podem ser usados para terapia, diagnóstico e outras aplicações de pesquisa dependendo da aplicação particular, para bloquear seletivamente diferentes ligandos, ou para bloquear múltiplos ligandos, ou para não completar com ligandos para ligação ao KIR3DL2.
[00359] Exemplo 8 - Mapeamento de Epítopo
[00360] Os mutantes de KIR3DL2 foram desenvolvidos para identificar os anticorpos específicos de KIR3DL2 que possuem propriedades de ligação desejadas. Os anticorpos terão vantajosamente uma ligação à maioria ou todos dos alelos KIR3DL2 principais na população (em termos de frequência de alelo) enquanto não ligando aos KIR3DL1 principais (por exemplo, alelo *00101).
[00361] As mutações foram geradas as quais correspondem aos resíduos que diferem entre KIR3DL1 e KIR3DL2. Um primeiro conjunto de mutações foram gerados no qual o aminoácido em KIR3DL1 foi substituído em KIR3DL2. Contudo, muitas destas proteínas mutadas falharam em expressar na superfície da célula, sugerindo que a incorporação do KIR3DL1 profundamente impactou a dobra da molécula de KIR3DL2 inteira. Em particular, mutantes nos clusters D21, D22, D23, D26 e D27 mostrados abaixo na Tabela 7A não expressam a superfície da célula.Tabela 7A
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[00362] Outros mutantes foram reprojetados e testados, com o conjunto final de mutações mostrados na Tabela 7B abaixo. Os anticorpos foram testados quanto a ligação KIR3DL2 a vários mutantes KIR3DL2. Os mutantes KIR3DL2 foram gerados por PCR (ver a tabela 7B abaixo). Todos os iniciadores Mx-R foram usados com o seguinte iniciador 5' ACCCAAGCTGGCTAGCATGTCGCTCACGGTCGTCAGCATG (SEQ ID NO: 79). Todos os iniciadores Mx-F foram uados com o seguinte iniciador 3' AGCACAGTGGCGGCCGCCTAGAAAA CCCCCTCAAGACC (SEQ ID NO: 80). As sequências amplificadas foram operadas em gel de agarose e depois purificadas usando a kit de Extração em Gel Qiagen.
[00363] Para criar os mutantes 12 e 21, foi necessário fazer um terceiro PCR. Os iniciadores usados para este PCR foram: iniciador M12a-F (5' GCCACAGGTGCATATGAGAAACCTT-CTCTCTCAGCC-3') (SEQ ID NO: 81 com o iniciador M12b-R (5'-TGGGTCACTTGCGGCTGACCACACGCAGGGCAGGG-3') (SEQ ID NO: 82) e iniciador M21a-F (5'-CGTGCCCTGCCCTACGTGTGGTCAAACTCAA GTGAC-3') (SEQ ID NO: 83) com the M21b-R primer (5'-ATG CAGGTGTCT GGGGATACCAGATTTGGAGCTTGGTTC-3') (SEQ ID NO: 84).
[00364] Os dois ou três produtos PCR gerados para cada mutante foram depois ligados em um vetor pcDNA3,1, digerido com a enzima de restrição NheI e NotI, com o sistema de InFusion (Clontech) de acordo com as instruções dos fabricantes.
[00365] Depois do sequenciamento, os vetores contendo as sequências mutadas foram preparadas como Maxiprep usando o Sistema Promega PureYield® Plasmid Maxiprep. Os vetores foram depois usados para a transfecção celular em HEK-293T usando Lipofectamina 2000 da Invitrogen de acordo com as instruções do fabricante.Tabela 7B
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[00366] Cada anticorpo foi testado para a ligação ao KIR3DL2 tipo selvagem e a cada um dos mutantes de domínio D0, D1 e D2. Os anticorpos não mostram qualquer perda da ligação ao KIR3DL2 tipo selvagem não mutados (WTaKIR3DL2) mas a perdem a ligação a um ou mais mutantes, deste modo identificando vários epítopos.
[00367] Um resumo é mostrado nas Tabelas 7C e 7D ("+" indica nenhuma perda significante da ligação, "+/-" indica uma diminuição na ligação (ou perda parcial da ligação) e "-" indica a perda substancialmente completa da ligação). A maioria dos anticorpos de D0 não internalizantes perdem substancialmente toda a ligação ao mutante 2 (quatro anticorpos: 10F6, 2B12, 18C6, 10G5). Todos estes anticorpos também possuem pelo menos a perda parcial da ligação ao mutante 2A3. Um anticorpo D0 que não de internalização apresentou a perda da ligação somente ao mutante 1 (9E10). Um anticorpo D0 que não internalizado (1E2) perde a ligação somente ao mutante 2A3. Um anticorpo (5H1) perde a ligação ao mutante 6.
[00368] O bloqueio do ligando natural e o anticorpo 13H1 de internalização adicionalmente mostrou a ligação diminuída ao mutante 2A2 e MDO/HLA1, além dos mutantes 1 e 2.
[00369] Como os anticorpos que ligam ao domínio D2 de KIR3DL2 (ambos de não internalização) os anticorpos 1C3 e 20E9 perdem a ligação ao mutante 14, como reservatório como perda parcial da ligação ao mutante 15 e mutante 16.
[00370] Os anticorpos 10F6, 2B12, 18C6 e 10G5 têm perda de ligação ao mutante 2 tendo substituições 160N e G62S e diminuição na ligação ao mutante 2A3 tendo substituições P14S, S15A e H23S, mas não perdem a ligação a qualquer outros mutantes. O principal epítopo destes anticorpos, portanto, incluem os resíduos 160 e/ou G62 (e o epítopo opcionalmente também inclui um ou mais de P14, S15, e H23). Os resíduos 60 e 62 estão dentro do domínio D0 de KIR3DL2.
[00371] O anticorpo 13H1 tem perda de ligação tanto ao mutante 1 tendo R13W, A25T e Q27R quanto ao mutante 2 tendo substituições160N e G62S. 13H1 também tem uma ligação reduzida ao mutante 2A2 (Q56S, E57A) e MDO/HLA1 mutante (F9S, S11A). o epítopo 13H1, portanto, inclui os resíduos F9, S11, Q56 e/ou E57. Estes resíduos estão dentro do domínio D0.
[00372] O anticorpo 9E10 tem uma ligação diminuída ao mutante 1 tendo substituições R13W, A25T e Q27R, mas não a qualquer outro mutante. o epítopo de 9E10 e 10G5, portanto, incluem os resíduos R13, A25 e/ou Q27.
[00373] A Figura 1 mostra uma visão do polipeptídeo KIR3DL2, incluindo as porções dentro do domínio D0, mostrando o resíduo de aminoácidos mutado indicado como "Mutante 1", "Mutante 2", "Mutante 3" e "Mutante 6" que resultou (em combinações diferentes) na perda de ligação por anticorpos. A Figura 2 mostra uma vista do polipeptídeo KIR3DL2, incluindo as porções dentro do domínio D0, mostrando os resíduos de aminoácido mutados indicados como "Mutante 1", "Mutante 2" e "Mutante 3" que resultou (em combinações diferentes) na perda de ligação por anticorpos, com variação de resíduos adjacentes aos resíduos (F9, S11, P14, F34 e/ou S140 adjacentes ao mutante 2, e G21, G22, H23, E57, S58, F59, P63 e/ou H68 adjacente ao mutante 1).
[00374] O anticorpo 5H1 teve perda de ligação ao mutante 6 tendo substituições R78H e L82P, mas não perde a ligação a qualquer outro mutante. O epítopo principal de 5H1, portanto, inclui resíduos R78 e/ou L82. Os resíduos R78 e L82 estão dentro do domínio D0 de KIR3DL2. Os resíduos expostos à superfície adjacentes a estes resíduos mutados também podem contribuir aos epítopos dos anticorpos. A Figura 3 mostra uma vista de cada face do polipeptídeo KIR3DL2, incluindo as porções dentro do domínio D0, que mostra o resíduo de aminoácidos mutados indicados como "Mutante 6" que resultaram (em combinações diferentes) na perda de ligação por anticorpos, com "Mutante 3" que não resultam na perda de ligação mostrada. Também mostrados em sombreados são os resíduos adjacentes aos resíduos adjacentes ao mutante 6 que também pode ser qualquer um através dos anticorpos (K7, Y30, R31, P79, H80, S81, T83, G84, W85, S86 e/ou A87).
[00375] Os anticorpos 1C3 e 20E9 têm perda de ligação ao mutante 14 tendo uma substituição W226A. os anticorpos adicionalmente possuem uma ligação diminuída ao mutante 15 tendo substituições I231M e R246P e ao mutante 16 tendo uma substituição E239G. O epítopo principal do 1C3, portanto, inclui os resíduos de W226. O epítopo principal de 20E9 podem incluir os resíduos I231M e/ou R246P, e/ou podem adicionalmente incluir E239. Os resíduos W226, 1231 e R246 estão na região da junção dos domínios D1 e D2 de KIR3DL2. Os resíduos expostos à superfície adjacentes aos resíduos mutados também podem contribuir aos epítopos dos anticorpos, incluindo por exemplo resíduos Q201, K202, P203, S204, S224, S225, S227, S228, N252, R253 e/ou T254 (referência a SEQ ID NO: 1) localizados na superfície de KIR3DL2 na região do epítopo W226 mas fora da região das mutações KIR3DL2 que não resultam na perda da ligação dos anticorpos (por exemplo, mutantes 12 e 17). Os expostos à superfície adjacentes aos resíduos mutados 1231 e R246 também podem contribuir aos epítopos dos anticorpos, incluindo por exemplo resíduos D230, 1231, R244, L245, R246, A247, V248, S275, R277 e/ou P280 (referência à SEQ ID NO: 1) localizados na superfície de KIR3DL2 na região do epítopo 1231/R246 mas fora da região das mutações KIR3DL2 que não resultam na perda da ligação dos anticorpos (por exemplo, mutantes 12 e 17).
[00376] A Figura 4 mostra uma vista do polipeptídeo KIR3DL2, incluindo as porções dentro do domínio D2 (junção D1/D2), mostrando os resíduos de aminoácidos mutados indicados como "Mutante 14" para os quais os anticorpos perdem a ligação, e "Mutante 12" e "Mutante 17" que não causam a perda da ligação pelos anticorpos; também mostrados em sombreado são os resíduos adjacentes aos resíduos (Q201, K202, P203, S204, S224, S225, S227, S228, N252, R253 e/ou T254 adjacentes ao mutante 14) que também podem ser ligados.
[00377] A Figura 5 mostra uma vista do polipeptídeo KIR3DL2, incluindo as porções dentro do domínio D2 (junção D1/D2), mostrando os resíduos de aminoácidos mutados indicados como "Mutante 15" para os quais os anticorpos perdem a ligação; também mostrados no sombreado estão os resíduos adjacentes aos resíduos (D230, 1231, R244, L245, R246, A247, V248, S275, R277 e/ou P280) adjacentes ao mutante 14) que também podem ser ligados.
[00378] As Figuras 18,19 e 20 mostram vistas dos polipeptídeos KIR3DL2, alelo *001, com o sítio de ligação de mutante 2 mostrado, e mostrando as diferenças de aminoácidos vistas em diferentes alelos KIR3DL2 tendo as maiores frequências (estudos das populações nos Estados Unidos). Pode ser visto que o sítio de ligação de anticorpos está em um local que é conservado através dos alelos de KIR3DL2, o que é consistente com a capacidade do anticorpo ligar as células a partir de todos os indivíduos testados. Tabela 7C: Mutantes do domínio 0
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Figure img0021
[00379] Todos os cabeçalhos e sub-cabeçalhos são aqui usados apenas por conveniência e não devem ser interpretados como limitantes da invenção de qualquer maneira. Qualquer combinação dos elementos acima descritos em todas as variações possíveis das mesmas é abrangida pela invenção a menos que de outro modo aqui indicado ou de outro modo claramente contraditos pelo contexto. A citação das faixas dos valores aqui apresentados são meramente intencionados servir como um método de abreviação para se referir individualmente a cada valor separado que caia dentro da faixa, a menos que aqui de outro modo indicado, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se fossem aqui citados. A menos que de outro modo determinado, todos os valores exatos aqui fornecidos são representativos dos valores aproximados correspondentes (por exemplo, todos os valores exemplares exatos fornecidos com relação a um fator ou medição particular ou podem ser consideras também fornecer uma medição aproximada correspondente, modificado por "cerca de," onde apropriado).
[00380] Todos os métodos aqui descritos podem ser realizados em qualquer ordem indicada a menos que de outro modo aqui indicado ou de outro modo contradito no contexto.
[00381] O uso de qualquer ou todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, "tal como") aqui fornecidos é intencionado meramente para melhor explicar a invenção e não apresenta uma limitação no escopo da invenção a menos que de outro modo indicado. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deve ser interpretada como indicando que qualquer elemento é essencial à prática da invenção a menos se muito explicitamente determinado.
[00382] A citação e incorporação dos documentos de patente aqui contidos é feita apenas por conveniência não reflete qualquer aspecto de validade, patenteabilidade e/ou obrigatoriedade de tais documentos de patente. A descrição aqui contida de qualquer aspecto ou forma de realização da invenção usando termos tais como referência a um elemento ou elementos é intencionada fornecer suporte a um aspecto ou forma de realização similares da invenção que "consiste de," "consiste essencialmente de ou "substancialmente compreende" aquele elemento ou elementos particulares, a menos que de outro modo determinado ou claramente contradito pelo contexto (por exemplo, uma composição aqui descrita como compreendendo um elemento particular deve ser entendida como também descrevendo uma composição consistindo daquele elemento, a menos que de outro modo determinado ou claramente contradito pelo contexto).
[00383] Esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes do assunto individual citados nos aspectos ou reivindicações aqui apresentadas até a extensão máxima permitida pela lei aplicável.
[00384] Todas as publicações e pedidos de patente aqui citados neste relatório descritivo são aqui incorporados por referência nas suas totalidades como se cada publicação ou pedido de patente individuais fossem especifica e individualmente indicados ser incorporados por referência.
[00385] Embora a presente invenção foi descrita em alguns detalhes por via de ilustração e exemplo para propósitos de clareza de entendimento, será prontamente evidente àquele de habilidade comum na técnica em consideração a estas divulgações desta invenção que algumas mudanças e modificações podem ser feitas a esta sem divergir do espírito ou escopo das reivindicações anexas.

Claims (11)

1. Anticorpo monoclonal, caracterizado pelo fato de que apresenta (i) uma cadeia pesada que compreende a CDR 1, 2 e 3 (HCDR1, HCDR2, HCDR3) que consiste na sequência da SEQ ID NO: 15 (HCDR1), SEQ ID NO: 18 (HCDR2) e SEQ ID NO: 20 (HCDR3) respectivamente, e (ii) uma cadeia leve que compreende a CDR 1, 2 e 3 (LCDR1, LCDR2, LCDR3) que consiste na sequência da SEQ ID NO: 10, 21 e 22, respectivamente, as CDRs sendo definidas conforme Kabat.
2. Anticorpo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada humana que se liga a um receptor de FcyIIIA.
3. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo se liga: (a) um polipeptídeo KIR3DL2 compreendendo a sequencia de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 160 (alelo *001), (b) um polipeptídeo KIR3DL2 compreendendo a sequencia de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 1 (alelo *002), e (c) um polipeptídeo KIR3DL2 compreendendo a sequencia de aminoácido mostrada na SEQ ID NO: 165 (alelo *007), em cada caso em que o polipeptídeo KIR3DL2 é expresso na superfície de uma célula.
4. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo detectavelmente reduz a ligação entre o KIR3DL2 e HLA-B27.
5. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo detectavelmente reduz a ligação entre o KIR3DL2 e HLA-B27, mas não reduz detectavelmente a ligação entre KIR3DL2 e HLA-A3.
6. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é capaz de induzir, via ADCC, a lise de uma célula que expressa KIR3DL2.
7. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo é um fragmento de anticorpo.
8. Anticorpo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser para uso como medicamento.
9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, e um carreador farmaceuticamente aceitável.
10. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir linfoma de célula T CD4+
11. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser na fabricação de um medicamento para tratar ou prevenir espondiloartrite.
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