NO863077L - Fremgangsmaate til mikrobiell hydroksylering av forskolin og dens derivater ved neurospora crassa. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen vedrører forskolin-analoge og derivater, en fremgangsmåte til deres fremstilling ved hjelp av mikro-

bielle omdannelser ved hjelp av Neurospora crassa, og anvend-elsen av stoffene som farmasøytisk middel, spesielt som me-dikamenter til behandling av glaukom, hjerteinsuffisiens, hypertonie, betennelser, allergier, bronchialsykdommer og sykdommer av immunsystemer.

Forskolin og dets naturlige forekommende analoge er en gruppe

av labdan-terpenoider, som isoleres fra planten Coleus for-skolii (Briqu.). Strukturformlene av forskolin og dets naturlig forekommende isolerte analoger, vises i formel I

For forskolin er R2= OH, R' = Ac, samt R3 til R7og R" = H.

Inntil i dag er det påvist følgende naturlig forekommende for-skolinanaloger:

1,9-didesoksy- R" = Ac, samt R.^til R7og R" = H,

forskolin:

9-desoksy- R1= OH, R<1>= Ac, samt R2til R7og R" = H, forskolin:

1,9-didesoksy-

7-deacetyl-

forskolin: R<1>, R" og R^til R^= H,

1-desoksy-

forskolin: R2= OH, R' = Ac, samt R" og Rx, R^til R^= H,

7-deacetyl-

forskolin: R^, R2= OH, R<1>,R", samt R3til R7= H.

6- acetyl-7- R, = OH, R" = Ac, samt R' og R2til R^= H, deacetyl-

forskolin:

(Tetrahedron Lett. 19, 1669 (1977), J. Med. Chem. 26, 486 (1983).

Forskolin er en av de viktige diterpener av planten Coleus for-skoli. Dette stoff og dets derivater kan anvendes som verdi-fulle legemidler ved behandling av forskjellige sykdommer som glaukom, hypertonie, hjerteinsuffisiens, betennelse, allergier, bronchokonstriksjon og rent generelt av sykdommer som blir frem-bragt ved forstyrrelser av cAMP-produksjonen og -metabolismen (indisk patent nr. 143 875 og tilsvarende DE-OS 25 57 784, indisk patent 145 926, indisk patent nr. 147 630 og tilsvarende DE-OS 26 40 275, Med. Res. Revs. 3, 201-19 (1983)).

En fremgangsmåte til isolering av hoveddelen av forskolin fra Coleus forskohlii er allerede omtalt (se indiske patenter nr. 143 975 og 145 926, DE-OS 25 57 784). Ved denne fremgangsmåte utvinnes dessuten forskolin-analoger. Disse analoger kan anvendes som mellomprodukter til fremstilling av forskolin. Det er allerede blitt omtalt metoder hvorigjennom analoge med samme oksydasjonstrinn som forskolin, f. eks. 7-deacetyl-forskolin og 6-acetyl-7-deacetylforskolin kan omdannes til forskolin (indisk patent 147 007, J. Chem. Perk. Trans. 1, 767

(1982)) .

Det er allerede omtalt en fremgangsmåte av mikrobiell omdannel-se hvorigjennom de mindre hydroksylerte forskolin-analoge omdannes til forskolin, 7-deacetyl-forskolin eller 6-acetyl-7- deacetylforskolin, eller i slike derivater som ved kjente kjemiske metoder lett lar seg omdanne til forskolin (tysk søk-nad P 35 02 685.5) .

Oppfinnelsens gjenstand er en mikrobiell fremgangsmåte til hydroksylering av Labdan-terpenoider med formel I

hvori

Rlog R2ketyr hydrogen eller hydroksy, til Rg betyr hydrogen, R' betyr acetylgruppen eller hydrogen og R" betyr hydrogen, ved hjelp av Neurospora-stammer, spesielt ved hjelp av stammer Neurospora crassa ATCC 9279, ATCC 9344, ATCC 10336, ATCC 10870. Fremgangsmåten erkarakterisert vedat en for-bindelse med formel I, hvori R^-R^, R<1>og R" har overnevnte betydning, fermenteres i et vanlig næringsmedium av definert sammensetning som inneholder en av de nevnte mikroorganisme-stammer. Fermenteringen foregår 3-5 dager ved en temperatur på 25-30°C, fortrinnsvis ved 28°C under rysting.

Næringsmediet inneholder karbon- og nitrogenkilder, eventuelt også uorganiske næringssalter samt sporelementer';

Som karbonkilder egner det seg f. eks. glukose, stivelse, dekstrin og glycerol. Egnede nitrogenkilder er f. eks. soja-mel, gjærekstrakt, kjøttekstrakt, maltekstrakt, maissvelle-vann, pepton og kasein. Som uorganiske næringssalter kommer det f. eks. på tale natriumklorid, magnesiumsulfat eller kal-siumkarbonat, som sporelementer f. eks. jern, magnesium, kobber, sink og kobolt i form av egnede salter.

Inntil avslutningen av omsetningen frafiltreres soppmycelet og det resulterende kulturfiltrat ekstraheres med organisk oppløs-ningsmiddel som diklormetan, kloroform eller etylacetat. Ek-straktet tørkes hensiktsmessig over tørkemidler som Na2SO^

og konsentreres i vakuum. Residuet renses deretter ved skille-fremgangsmåten som eksempelvis kromatografi og ved krystalli-

sering.

Hydroksyleringen foregår fortrinnsvis i 1-, 2- og/eller 3-stilling.

Generell fremgangsmåtebeskrivelse:

a) StammehoTd og dyrking.

Sporesuspensjoner av overnevnte stammer podes på små skrårør

med følgende næringsmedium og dyrkes 14 dager ved 30°C:

Stammeholdnæringsmedium:

Til dyrkning i væskekulturer utvinnes fra stammene sporesuspensjoner ved oppsvømming av de små skrårørene med steril NaCl 0,8 %, og denne fortynnes til en titer på 1 x 10^ sporer/ ml. 0,5 ml av denne suspensjon tjener som inokulum av 50

ml hovedkultur (i 100 ml Erlenmeyerkolbe) av følgende sammensetning:

Hovedkulturnæringsoppløsning:

Etter 30-40 timer ved 29°C og en rystefrekvens på 19 0 omdr./ min, oppnår man en tett mycelaktig vekst.

b) B io t r an s f o rrnasjon.

Til biotransformasjon overføres det 50 ml hovedkultur i en

steril 300 ml Erlenmeyerkolbe og tilsettes 16 mg substrat (oppløst i metanol). Deretter rystes suspensjonene ved 28°C og 240 omdr./min 3-5 dager. Fremgangen av biotransformasjonen følges ved hjelp av tynnsjiktkromatografi (HPTCL-plater, metyl-enklorid/etylacetat = 3/1, anisaldehyd-svovelsyre som påvis-ningsreagens). Etter omsetningens avslutning frafiltreres soppmycelet, den resulterende kulturfiltrat ekstraheres med samme mengde diklormetan og inndampes.

c) Transformasjonsprodukte r (strukturer se tabell 1)

I) 1,9-didesoksyforskolin (1) 1 a-HO-DDF (5)

(DDF) ( = 9-desoksyforskolin)

2 a-HO-DDF (8)

3 a-HO-DDF (9)

II) 7-dAc-l,9-didesoksforskolin (11)

7-dAc-9-desoksyforskolin (12)

III) 1-desoksyforskolin (3)->forskolin (2)

IV) forskolin (2) 3a-HO-forskolin (10)

6Ac-7dAc-3a-HO-forskolin (13) .

Omsetningseksempler med N. crassa ATCC 10336

Eksempel 1

Biotransformasjon av 1,9-didesoksyforskolin (DDF). Gjennomføring ifølge 1 b) 120 timer

DC-analyse av reaksjonsproduktet:

Eksempel 2

Biotransformasjon av 1-desoksyforskolin

Gjennomføring ifølge 1 b) 72 timer,

DC-analyse av reaksjonsproduktet:

Eksempel 3

Biotransformasjon av forskolin,

gjennomføring ifølge 1 b) 72 timer,

DC-analyse av reaksjonsproduktet:

Eksempel 4

En ifølge eksempel 1 gjennomført biotransformasjon av DDF

ga etter ekstrahering med etylacetat 97,8 mg tørrstoff.

Denne mengde ble oppløst i diklormetan, impregnert på 1 g kiselgel 60 (Grace, 31 ym, pH 7,0), og deretter fylt i en forsøyle. Over forsøylen ble deretter prøven kromatografert på hovedsøylen (102 ml kiselgel, se ovenfor) ved en strømning på 2 ml/min med diklormetan/aceton = ..15/1. Etter ca. 22 timer ble den mobile fases polaritet øket til 10/1. De enkelte fraksjoner (a 14 ml) ble analysert på stoffinnhold pr. DC (CH2Cl2/aceton = 7/1, deteksjon med anisaldehyd/H2S04/eddik-syre som omtalt ovenfor).

Ved siden av uomsatt DDF ble det oppnådd 2,1 mg ND1 (Rf 2 0,64) . 4,2 mg ND2 (Rf = 0,46) og 7,9 mg av en blanding ND2 og ND3

(Rf = 0,36). Denne blanding ble spaltet over preparativ tynnsjiktkromatografi til 3,5 mg ND2 og 4,0 mg ND3.

Eksempel 5

En ifølge eksempel 3 gjennomført biotransformasjon av forskolin ga etter ekstrahering med etylacetat 57,1 mg tørr-stoff.

Denne mengde ble oppløst i 1,7 ml CH2C12og kromatografert over en kiselgelsøyle (Merck, KG 60, 15-40 ym, 102,5 ml søyle-volum) med den mobile fase CH2Cl2/aceton = 12/1 ved 2,5 ml/ min. Etter 8 timer ble den mobile fase anvendt med forholdet 9/1.

Ifølge DC"^ får man i det vesentlige ikke omsatt forskolin, 7-desacetyl-forskolin og de nye stoffene NF2, NF3 og NF4.

En etterrensning av mellomfraksjonene førte til 0,9 mg NF3 og 0,7 mg NF4.

1) Kiselgelplater Merck, F254 10 x 20 cm

mobil fase: petroleter/etylacetat = 2/1

Deteksjon: se eksempel 4.

3g- hydroksy- forskolin ( NF 3)

N-NMR (270 MH2, CDC13, TMS) 6= 5,96 (dd, J = 10 Hz, J<»>=18 Hz 14-H), 5,57 (d, J = 4 Hz, 7 a-H), 5,30 (d, J = 18 Hz +

homoallylkobling, 15 t-H), 4,99 (d, J = 10 Hz + homoallylkobling, 15 c-H), 4,65 (forbrukt t. J = 4 Hz, 1 a-H), 4,41 (forbrukt, t, J = 5 Hz, 6 a-H), 3,52 (forbrukt, t. J = 4Hz, 3 B-H), 2,85 (AB med 6A = 3,20 og 6= 2,50, JAB= 17 Hz, 12-H), 2,63 (d, J=4 Hz, 5 a-H)

2,14 (AB med 6A2 2,34 og 6B 2 1,94, JAB= 16 Hz, tilsatt J'= 3 Hz til t, 2-H) , 2,20 (s, OCOCH3) ,1,88-0,80 (resterende signaler deri, 5g, hver 3H ved 6 = 1,73, 1,43, 1,37, 1,28 og 1,12, CH3).

MS m/z = 427 (18, M<+>+H), 426 (4, M<+>), 408 (78, M<+->H20)

391 (46), 380 (16), 331 (28), 125 (100), 109 (90 %) .

3a- hydroksy- T, 9- didesoksy- forskolin ( ND2)

1 un

H-NMR (270 MHz, CDC13, TMS) 6 = 5,95 (dd, 10 Hz, J'= 18 Hz,

14-H), 5,27 (d, J = 18 Hz + homoallylkobling, 15 t-H), 5,14 (d, J= 4Hz + 7 a-H), 5,06 (d, J = 10 Hz + homoallylkobling, 15 c-H), 4,21 (forbrukt s, 6 a-H), 3,38 (forbrukt.s, 3 B-H), 2,82 (s, 9 a-H), 2,60 (AB med 6A= 2,65 og 6B = 2,55, JAfi= 16 Hz, 12-H), 2,30 - 2,00 (m, 5 H deri 2,21, s, OCOCH3), 1,78 - 0,75

(rest. H, deri 4s, 1,52, 1,43, 1,22, 1,03 for CH3)

MS m/z= 379 (M<+->CH3), 361 (M<+->CH3H20), 334 (M<+->AcOH),

319 (M<+->CH3-AcOH), 251, 222, 167, 151, 95, 71 %.

Fig. 1 og 2 viser H-NMR-signalene av de togforbindelser ND2 resp. NF3 i området 5 = 1,80 - 6,50.

Claims (7)

1. Fremgangsmåte til mikrobiell hydroksylering eller oksydering av labdan-terpenoider med formel I

hvori og R2 betyr hydrogen eller hydroksy, R^ til Rg betyr hydrogen, R^ betyr hydrogen eller hydroksy, R' betyr acetylgruppen eller hydrogen, og R" betyr hydrogen, karakterisert ved at man på en av de nevnte forbindelser med formel I som substrat i et vanlig næringsmedium lar det innvirke en mikroorganismestamme Neurospora crassa og de dannede forbindelser isoleres etter avslutning av fermenteringen fra kulturvæsken med ekstrahering med et organisk oppløsningsmiddel, og etterfølgende kromatografi, og/ eller krystallisering.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes stammen Neurospora crassa ATCC 9279, ATCC 9344, ATCC 10336 eller 10780.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at fermenteringen gjennomføres 3-5 dager ved 25-30°C under rysting og kulturfiltratet ekstraheres med diklormetan.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at det fermenteres ved 28°C.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1-4, karakterisert ved at hydroksyleringen foregår i 1-, 2- og/eller 3-stilling.

6. 3a-hydroksyforskolin.

7. Legemiddel, inneholdende 3a-hydroksyforskolin.