MXPA06006773A - Composicion para mejorar la salud de la piel, el cabello y el pelo, que contiene flavanonas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion corresponde a una composicion para prevenir, disminuir y/o tratar los desordenes de la piel y el cabello/pelo, tales como los que son efecto de reacciones inflamatorias, factores ambientales, envejecimiento o cancer. En particular, la presente invencion se refiere al uso de compuestos de flavanonas o sus derivados en composiciones nutricionales, cosmeticas o farmaceuticas para el mejoramiento de las condiciones de la piel y el pelo del humano o del animal de mascota.

Description

COMPOSICIÓN PARA MEJORAR LA SALUD DE LA PIEL, EL CABELLO Y EL PELO, QUE CONTIENE FLAVANONAS La presente invención corresponde a una - composición para prevenir, disminuir y/o tratar los desórdenes o daños a la piel y al cabello/pelo, tales como los que son efecto de reacciones inflamatorias, factores ambientales, envejecimiento o cáncer. En particular, la presente invención se refiere al uso de compuestos de flavanonas o de sus derivados en composiciones - nutricionales, cosméticas o farmacéuticas para el mejoramiento de la piel humana o de mascotas y de las condiciones del pelo.

Entorno de la invención. El tejido epitelial más prominente en los seres vivos es la piel, que representa el órgano más grande en el organismo. El sistema de integumento de la piel, que ' comprende la epidermis, la dermis y el estrato córneo, se ' correlaciona con el de los órganos internos y concurrentemente actúa con los alrededores . Siendo la conexión entre el ambiente y el propio organismo, la piel está fuertemente influenciada por los factores externos y también por parámetros variables del sistema interno del organismo. Los mecanismos reguladores de la piel necesitan por lo tanto estar siempre activos para inducir los cambios sistémicos necesarios para mantener los eventos patológicos normales referentes a la morfología y las actividades del integumento de la piel .

Una gran cantidad de procesos que aseguran el consumo adecuado de la afluencia incrementada de sustancias energéticas y plásticas de acuerdo con las necesidades de la piel, se convierten en garantes de la estabilidad morfológica y funcional de las estructuras de la piel. Asi, el estado de los integumentos determina la realización de los procesos metabólicos necesarios para la viabilidad y la actividad celulares que conducen a la presencia de las peculiaridades de la piel sana, tales como función de barrera, elasticidad, propiedades de turgencia, humedad, pigmentación, etc.

Durante el periodo de vida de un ser vivo, aparecen en la piel y el cabello diferentes signos, característicos del envejecimiento, siendo los principales signos clínicos la aparición de lineas finas y de arrugas profundas que aumentan o se acentúan con la edad, • la pérdida de cabello, la densidad reducida del cabello, el brillo, el color, oleosidad, el diámetro de la fibra, etc.

Estos signos de envejecimiento son incluso promovidos por la exposición de la piel y del cabello a influencias exógenas, tales como p. ej . , radiación UV, • contaminantes, radicales libres o sustancias químicas.

En la técnica se han propuesto varios medios para prevenir los efectos destructivos del ambiente o del envejecimiento en las células epiteliales. Por ejemplo, el medio para prevenir el deterioro de la piel o el - envejecimiento es el proporcionar compuestos que expulsen los radicales libres. A este respecto, la Patente EP 0 761 214 describe camisetas supresoras de oxigeno que comprenden derivados de anilina y derivados de difurfuril amina, que se reportan como reductores del estrés oxidante para la piel.

Aunque hay una gran diversidad de compuestos activos para mejorar la salud de la piel y del cabello o pelo, aún existe una necesidad en la técnica de proporcionar nuevos compuestos activos. En particular, un objetivo de la presente invención es el proporcionar composiciones que puedan ser usadas por humanos o mascotas durante un periodo largo de tiempo, y susceptibles de ser proporcionadas en la forma de un suplemento nutriciohal, ' por ejemplo una composición nutricional.

Descripción de la invención. En un primer aspecto, la presente invención se refiere a una composición nutricional, cosmética o farmacéutica para humanos o mascotas, que contiene como ingrediente activo al menos un compuesto de flavanona o sus derivados, o una mezcla de los mismos, de una manera eficiente para prevenir, tratar • o aliviar los desórdenes de la piel, el cabello y/o el pelo y mejorar la salud de la piel, el cabello y/o el pelo.

En otro aspecto, la invención proporciona el uso de al menos una flavanona o sus derivados o mezclas de los mismos, como un compuesto activo en la preparación de una composición nutricional, cosmética o farmacéutica diseñada para prevenir o tratar los desórdenes de la piel, el cabello y/o el pelo, mejorando con ello las condiciones de salud de la piel en humanos o mascotas.

La composición de acuerdo con la presente invención puede tener la forma de una fórmula nutricional completa, un suplemento dietético para ser administrado oralmente a un humano o a un animal, o un compuesto para uso farmacéutico.

La administración a un humano o a un animal de mascota de una composición de alimento como la arriba descrita, da como resultado una salud mejorada de la piel, p. ej . , fotoprotección, hidratación, sequedad, firmeza, grosor, elasticidad, oleosidad, pigmentación regular, inmunidad, o salud para el cabello y el pelo, p. ej . , mejora en el brillo del cabello y pelo, la densidad del cabello, el color, oleosidad, mejoramiento del diámetro de la fibra de cabello, la producción de sebo, el brillo y la' prevención de la pérdida de cabello y pelo. La composición de acuerdo con la invención también es administrada a un humano o a un animal para mejorar el estado antioxidante, la función de barrera, para prevenir o modular el estado de oxidación, la producción o la composición del sebo, o para reducir los signos de envejecimiento. También ayuda a reducir riesgos de cáncer o de inflamación.

Descripción detallada de la invención. De acuerdo con el primer objetivo, la invención proporciona una composición nutricional, cosmética o farmacéutica para administración oral para humanos o mascotas, que contiene como compuesto activo al menos un compuesto de flavanona o sus derivados, o una mezcla de los mismos, en una cantidad eficiente para prevenir, tratar o aliviar los desórdenes o los daños n la piel, el. cabello y/o el pelo, y por lo tanto para mejorar la salud de la piel, el cabello y el pelo.

Los compuestos de flavanona de interés son los glicósidos naturales que pueden encontrarse principalmente en las frutas del género Citrus, tales como naranja, limón, naranja agria, toronja, por ejemplo, o hasta un menor punto en otros vegetales. Están presentes en su mayoría en la cascara de la fruta, pero también en grandes cantidades en la pulpa y por lo tanto también en el jugo de la fruta cítrica. Los compuestos de acuerdo con la presente invención pueden ser: isosacuranetina, naringina, hesperidina, o eriodictiol, poncirina, neoeriocitr.ina, por ejemplo, y sus derivados seleccionados de entre las formas de aglicona, las formas de ' chalcona, las formas glicosilatadas o las formas metiladas. También se usan sus formas sulfatadas o glucuronidatadas que se encuentran como producto del metabolismo en sangre.

En un último aspecto, los derivados pueden obtenerse a través de varios procesos conocidos en la técnica, tales como los tratamientos enzimáticos. Por ejemplo, la glucosa-7-hesperetina se prepara por tratamiento de la ramnosidasa o la hesperidinasa.

El compuesto de flavanona o sus derivados de acuerdo con la invención pueden ser incluidos en cualquier composición adecuada para administrar la sustancia a un individuo, n particular una composición de alimento, una composición cosmética o una composición farmacéutica.

En una representación preferible, se prepara una composición de alimento para el consumo humano. Esta composición puede ser una fórmula nutricional completa, un producto lácteo, una bebida fria o estable en el anaquel, sopa, un suplemento dietético, un sustituto de carne, una barra nutricional o una golosina. La composición puede ser seleccionada de entre el grupo consistente de: leche o productos de leche fermentada, tales como p. ej . yogurt, requesón, queso, productos fermentados con base de leche, helados, polvos con base de leche, fórmulas infantiles, productos de cereal y productos con base de cereal fermentado, bebidas, agua mineral, chocolate o alimento para mascotas, que contengan al menos un compuesto de • flavanona o uno de sus derivados . El suplemento nutricional para la administración oral puede ser en cápsulas, cápsulas suaves, tabletas, pastas o pastillas, gomas, o soluciones o emulsiones bebibles. Los métodos para prepararlos son . del conocimiento común .

Como se describió arriba, los compuestos de flavanonas se encuentran naturalmente en las frutas cítricas, en particular en naranjas, limones y toronjas, en su cascara o su pulpa. De acuerdo con ello, en un primer aspecto la composición nutricional puede ser en forma de un jugo de esas frutas o en la forma de un concentrado. Por lo tanto, la composición nutricional puede estar en la forma de cualquier ' producto de alimento, en particular en cualquier bebida, jugo de cítricos o en cualquier otro extracto de la cascara o la pulpa de las frutas cítricas.

En otra representación, un producto usual de alimento puede ser enriquecido con las flavanonas, preferiblemente en la forma de extracto del cítrico. Por ejemplo, una leche fermentada, un yogurt, un queso fresco, una leche reconstituida, una barra de golosina, hojuelas o barras de cereal para el desayuno, bebidas, polvos de leche, productos con base de soya, productos fermentados no lácteos o suplementos nutricionales para la nutrición clínica. En particular, en las Patentes US N02,400,.693 y US 2,442,110 se describe un proceso para preparar un extracto enriquecido si las flavanonas, en particular la hesperidina, provienen de la naranja y del limón, respectivamente .

De acuerdo con otro aspecto, los compuestos de flavanonas que serán incluidos en la especificación pueden ser producidos sintéticamente.

Un compuesto nutricional de acuerdo con la presente invención puede comprender los compuestos ' de flavanonas, sus derivados o mezclas de los mismos en una cantidad adaptada para una administración oral diaria, y de desde cerca de 0.01 mg hasta 1 g, preferiblemente desde cerca de 0.1 mg hasta 800 mg, más preferiblemente desde 10 mg hasta 800 mg del equivalente de aglicona del compuesto de flavanona.

Las flavanonas de acuerdo con la invención pueden ser usadas solas o en asociación con otros compuestos activos tales como vitamina C, vitamina E (tocoferoles y tocotrienoles) , carotenoides (carotenos, licopeno, luteína, . ceaxantina, beta-criptoxantina, etc.), ubiquinones (p. ej . CoQlO) , catequinas (p. ej . galato de epigalocatequina) , extractos de café que contengan polifenoles y/o diterpenos (p. ej . , kawheol y cafestol) , extractos de chicoria, extractos de gingko biloba, extractos de uva o de semilla de uva ricos en proantocianidinas, extractos de especias • (p. ej . romero), extractos de soya que contengan isoflavonas y fitoestrógenos relacionados y otras fuentes de flavonoides con actividad antioxidante, ácidos grasos, p. ej . ácidos grasos n-3, fibras prebióticas, microorganismos probióticos, taurina, resveratrol, aminoácidos, selenio y precursores de glutationa, por 5 ejemplo.

En otra representación, pueden administrarse unas composiciones farmacéuticas para tratamientos profilácticos y/o terapéuticos. En las aplicaciones terapéuticas, las 10 composiciones se administran a un paciente que ya sufre de una enfermedad, como se describe aquí abajo, en una . cantidad suficiente para curar o al menos detener parcialmente los síntomas de la enfermedad y - sus complicaciones. Una cantidad adecuada para lograr' esto se 15. define como "una dosis terapéuticamente efectiva". Las cantidades efectivas para esto dependerán de la severidad de la enfermedad y del peso y el estado general del • paciente. 0 En las aplicaciones profilácticas, las composiciones de acuerdo con la invención se administran a un. paciente susceptible a, o de otra manera en riesgo de, una enfermedad particular. Esa cantidad es definida para • ser "una dosis profiláctica efectiva". En este uso, las 5 cantidades precisas dependen de nuevo del estado general de salud y del peso del paciente. Preferiblemente, para los humanos la composición farmacéutica de la invención comprende una cantidad de compuestos de flavanona, sus derivados o mezcla de los mismos como se describe arriba, para una administración diaria, de desde cerca de 0.01 mg hasta 500 mg. Cuando se administra diariamente a las mascotas, la composición puede comprender desde 1 mg hasta 500 mg del equivalente de aglicona de los compuestos de flavanona.

Los compuestos de la invención se administran preferiblemente con un portador farmacéuticamente aceptable, difiriendo la naturaleza del portador con el modo de administración, por ejemplo, las vías parenteral., intravenosa, oral y tópica (incluyendo la oftálmica) .

Se apreciará que la persona experimentada en la técnica, con base en su propio conocimiento, elegirá los componentes y la forma galénica adecuados para llevar el compuesto activo a la piel o el cabello tomando en cuenta la ruta de administración, que .puede ser a través de inyección, aplicación tópica, administración intranasal, administración por sistemas implantados o transdérmicos de liberación sostenida, y similares.

La sustancia del objetivo también puede ser formulada en un producto cosmético, tal como lociones, shampooes, cremas, filtros solares, cremas para después del bronceado, bloqueadores de sol, cremas antienvejecimiento y/o pomadas. Se apreciará que los presentes productos cosméticos contendrán una mezcla de diferentes ingredientes conocidos por la persona experimentada, que aseguren una penetración rápida en la piel de la sustancia del objetivo y que prevengan la degradación de la misma durante el almacenaje.

Se entenderá que el concepto de la presente invención puede, de igual manera, ser aplicado como una terapia adyuvante que ayude en las medicaciones actualmente usadas. Dado que los compuestos de la presente invención pueden ser fácilmente administrados junto con material de . alimento, puede aplicarse alimento clínico especial que contenga una alta cantidad de las sustancias del objetivo. Será claro que, al leer la presente especificación junto con las reivindicaciones adjuntas, la persona experimentada contemplará una variedad de diferentes alternativas para las representaciones específicas aquí mencionadas.

En principio, los compuestos de acuerdo con la presente invención pueden ser usados para el tratamiento y/o la prevención de daños en la piel que son producidos por una situación de estrés, p. ej . , por medio de un estrés químico, biológico o físico, p. ej . por la exposición a oxidantes o carcinógenos, exposición a bacterias, virus, 5 hongos, lípidos derivados de células circundantes y/o microbios, o exposición a la irradiación UV.

En consecuencia, las sustancias y/o las composiciones de acuerdo con la presente invención pueden 10 ser utilizadas para tratar y/o prevenir daños en la piel, en particular los daños actínico y de envejecimiento de la piel, tales como sequedad, queratosis actínica, pigmentación irregular (que comprende notablemente pecas, lentigosis, hipomelanosis gotosa e hiperpigmentación 15 persistente) , arrugamiento (que comprende notablemente líneas superficiales finas y surcos profundos) , . seudoescaras estrelladas, elastosis, inelasticidad, telangiectasia, lagunas venosas, púrpura, comedones, hiperplasia sebácea, acrocordón, angiogema ' cereza, 20. queratosis seborreica, lentigo, carcinoma basal celular y carcinoma escamoso celular, quemadura y/o ampolladura de la piel, hiperplasia epidérmica, inflamación, inmunosupresión, • y cáncer, etc., p. ej . los cánceres de no melanoma y de piel. También tienen beneficios particulares en el cabello 25 y el pelo, tales como densidad del cabello o del pelo, diámetro de la fibra, color, oleosidad, brillo y producción de sebo mejorados, y ayuda para prevenir la pérdida de cabello o pelo. 5 El efecto en el alimento de un suplemento de compuestos de flavanonas o de sus derivados de acuerdo con la presente invención, en la piel de humanos o mascotas, puede ser medido usando métodos convencionales que incluyen dosis eritemal mínima (MED, siglas en ingles), 10 colorimetría, pérdida de agua transepidérmica, reparación del ADN (e.g.p.53), medida de producción de interleucinas y , -- proteoglicanos, o actividad de colagenasa, función de barrera o renovación celular. 15 Los siguientes ejemplos ilustran la invención con mayor detalle sin restringir a la misma. Son precedidos por una breve descripción de las Figuras .

Figura 1: se incubaron células HaCat con 10 µM de 0 hesperetina (hp, barras rojas) ó 10 µM de hesperetin-7-0- glucurónido (hp-7-O-gluc, barras amarillas) o cantidades iguales de DMSO como un control (barras azules) y se trataron con o sin menadiona durante 5 h adicionales. El flotante fue analizado para la actividad de lactato 5 dehidrogenasa (LDH) y los resultados se expresaron con relación a las células que fueron usadas con trition-XlOO antes del análisis (100% muertas) .

Figura 2: lámina que represente el establecimiento experimental del ensayo de desarrollo de hesperidina.

Figura 3: análisis histopatológico de piel de rata suplementada con hesperidina, secciones de parafina de 6 um se desenceraron, se mancharon con hematoxilina/eosina. y se montaron. Se muestran las imágenes representativas en dos amplificaciones para el grupo de control (A y D) y para los grupos suplementados con hesperidina (0.1%: B y E, 0.5% C y F).

Figura 4: análisis PCR en tiempo real del ARN total aislado de piel de rata alimentada ya sea con una dieta de control (ctrl) o con una dieta suplementada con hesperidina (0.1% Hp, 0.5% Hp) para la expresión de CDldl e interleucina 6 (IL-6) . Las muestras se analizaron en 3 grupos que contenían 4 ratas cada ' uno y los valores de Ct obtenidos se muestran para CDldl en A, y para IL-6 en B. Los puntos representen los promedios, de triplicados técnicos, las barras el promedio total por grupo. En C se muestran los cambios de doblez en la expresión relativa de la suplementación comparada con la dieta de control y en relación con un gen gobernante. La dieta de control se estableció a 1 doblez y se representa con una línea gruesa. Los intervalos de confianza se calcularon usando ANOVA.

Ejemplo 1. Agua mineral suplementada con flavanona. Se preparó un agua mineral añadiendo hesperetin- 7-glucosa, en una cantidad de 0.01 mg a 200 mg por litro, estimado que el consumo promedio es de cerca de 1 litro por día.

Ejemplo 2. Cosmético para administración oral. Una composición en forma de cápsula dura tiene la siguiente formulación: La composición puede administrarse al individuo en una cantidad de 2 a 3 cápsulas diarias .

Ejemplo 3. Alimento enlatado para mascotas y suplemento .

Se preparó una mezcla de 73% de huesos de aves, pulmones, de cerdo e hígado de res (molido), 16% de harina de trigo, 7% de agua, 2% de colorantes, saborizantes, vitaminas y sales inorgánicas. Esta mezcla se emulsionó a 12°C y se extrudió en forma de pudín, que luego fue cocinado a una temperatura de 90°C. Se enfrió hasta 30°C y se cortó en trozos. 45% de los trozos fueron mezclados con 55% de una salsa preparada a partir de 98% de agua, 1% de colorante y 1% de goma guar. Se llenaron latas de hoja de estaño y se esterilizaron a 125°C durante 40 min.

Como un suplemento para ser mezclado con la , ración de alimento para mascotas antes de servirla, se proporciona un empaque adicional en forma de bolsita con 50 mg de equivalente de hesperetina, en forma de extracto de cítrico. Esto se proporciona como un suplemento con un removible unido a la lata, junto con las instrucciones del alimento.

Ejemplo 4. Alimento funcional. Se preparó un suplemento de alimento mezclando o revolviendo fructooligosacárido con inulina en las proporciones por peso de cerca de 70% de fructooligosacárido a cerca de 30% de inulina y añadiendo 500 mg de equivalente de hesperetina. La mezcla prebiótica resultante puede ser añadida a, o mezclada con, cualquier portador adecuado, por ejemplo una leche fermentada, un yogurt, un queso fresco, una leche reconstituida, una barra de golosina, hojuelas o barras de cereal para desayuno, una bebida, polvo de leche, un producto con base de soya, un producto fermentado no lácteo o un suplemento nutricional para la nutrición clínica.

Ejemplo 5. Material y métodos . Ensayo de citotoxicidad. Queratinocitos humanos inmortalizados (HaCaT) fueron incubados con 10 µM de hesperetina, 10 µM de hesperetin-7-O-glucurónido o cantidades iguales .de DMSO como un control negativo para 16 h y 1 h antes de la prueba. Luego las células fueron tratadas con 100 µM de menadiona, un xenobiótico que genera intracelularmente especies de oxígeno reactivo. Las células no tratadas con menadiona se usaron como un control positivo. Después de 5 h se analizó el flotante para la actividad de. lactato dehidrogenasa (LDH) como una medida para la muerte celular usando la prueba Cyto Tox 96 de citotoxicidad no radioactiva (Promega, EUA) .

Muestras de piel . Se obtuvieron biopsias de piel de rata del ensayo de desarrollo de Heperidina (Figura 2) . Se extirpó piel dorsal, una parte se fijó en 4& de PFA y parafina integrada, una parte fue criopreservada y otra parte fue inmediatamente congelada en nitrógeno líquido.

Histología. Secciones de parafina . Se dísectó piel de rata y se fijó durante 4 días en 4% de paraformaldehído en PBS (pH 7.4) a 4°C y se embebió en parafina usando un aparato de embebido Microsistema Leica. Los tejidos fueron lavados en PBS y salina (NaCl al 0.9%) y deshidratados pasándolos a través de soluciones salinas con concentraciones crecientes de etanol: 30 minutos cada una, en 30%, 50%¿ 70%, 90%, 99%, 100%, y una hora adicional en 100%. las muestras de tejidos fueron incubadas dos veces durante 30 minutos en xileno, seguido de incubaciones de 2-3 h y de 3 h en cera de ' parafina a 60°C. Se cortaron secciones delgadas de parafina de 6 µm usando un Micrótomo Leica. Las secciones fueron desenceradas 5 min en xileno y deshidratadas pasándolas a través de una serie de soluciones con concentraciones decrecientes de etanol: 1 min cada una en.100%, 96%, 90%, 80%, 70%, y 50% de etanol. Finalmente, fueron transferidas a agua destinada y manchadas.

Manchado con hémat oxi lina /eos ina . ' " Las secciones rehidratadas fueron manchadas durante 45 seg en solución de hematoxilina de Mayer, enjuagadas con la siguiente serie de soluciones, durante 1 min cada una: agua destilada, agua del grifo, agua destilada y 70% de etanol. Después de mancharlas durante 10 seg en solución de eosina (1% (v/v) en etanol al 90%};,. las • secciones fueron enjuagadas en etanol al 90% y al .-100%.

Enseguida de dos incubaciones de 10 min en xileno, se montaron dos cubiertas deslizantes con Eukit y se secaron al aire durante 2 h a temperatura ambiente.

Métodos de ARN. Instrucciones generales para trabajar con ARN. Para los experimentos con ARN, se han usado recipientes de plástico estéril o de vidrio horneado (180°C 5. durante al menos 8 h) . Todas las superficies fueron limpiadas con RNasa ZAP antes del uso, incluyendo los pipeteros, y sólo se usaron puntas resistentes al aerosol.

Eqxi±po . 0 Sistema de Detección de Secuencia ABI PRISM® - 7000HT, Applied Biosystems, EUA. Software AB1 PRISM® 7000 RT-PCR, Applied Biosystems, EUA. Ciclador PCR., p. ej . Controlador Térmico Programable PTC-100, MJ Research, Inc., EUA. Bioanalizador Agilent 2100, Agilent Technologies, EUA. Lector de Placa de Florescencia, p. ej . , Spectra Fluor Plus F 129005, Teca, EUA. Heraeus Multifuga 3S, con paletas especiales para - centrifugación MFC, Kendro Laboratory Products, Suiza. Centrífugo Enfriador, p. ej . Centrífugo 5417R, Eppendorf, Alemania.

.Reagentes . Equipo Totalmente ARN (Art. NO. 1910), Ambion, EUA. Matriz D Lisadora (Art. NO. 6913-100), Q BlOgene, Francia. Nano Prueba 6000 de ARN (Arts. No. 5065-4475 y 5065-4476), Agilent Technologies, EUA. Pruebas sobre pedido (material 20x, Applied Biosystems, EUA) . RNasa ZAP (Art. No. 9780), Ambion, EUA). Agua libre de nucleasa (ddH20, Art. No. 9939), Ambion, EUA) . Agua filtrada Mili-Q (0.22 µM, ddH20) Etanol, GR para análisis (Art. No. 02860), Fluka. Salina reguladora de fosfato de Dulbecco (PBS, Art. No. D8537), Sigma. ß-mercaptoetanol (Art. No. M7522), Sigma, EUA). Equipo RiboGreen de Cuantificación de ARN (Art . No. R-11490), Molecular Probes, EUA. Inhibidor SUPERase-In RNasa (20 U/µl, Art. No. 2694) , Ambion, EUA. Transcriptasa inversa SuperScript II RNasa H~ (200 U/µl, Art. No. 18064-014), Invitrogen, EUA. Regulador de primer cordón (5x) : 250 mM de NaCl, ' 0.1 mM de EDTA, 1 mM de DTT, 0.1% (v/v) NP-40, 50% (v/v) glicerol, incluido con la transcriptasa inversa SuperScript II RNasa H". 2' -deoxiadenosin-5' -trifosfato (dATP, 100 mM, Art. No. 272050), Amersham Biosciences, Inglaterra. 2' -deoxicitidina-5' -trifosfato (dCTP, 100 mM, Art. No. 272060), Amersham Biosciences, Inglaterra. 2' -deoxiguanosina-5' trifosfato (dGTP, 100' 'mM, Art. No. 272070), Amersham Biosciences, Inglaterra. 2'-deoxitimidín-5' -trifosfato (dTTP, 100 -mM, Art. No. 272080), Amersham Biosciences, Inglaterra. pd(N)6 hexámero aleatorio (Art. No. 27-2166-01), Amersham Biosciences, Inglaterra. Mezcla Maestra PCR Universal TáqMan (Art. 'No. ON4304437), Applied Biosystems, EUA.

Tabla 1: Ensayos sobre pedido usados (ID del ensayo), incluyendo nombres de los genes, símbolos de los genes y secuencias de referencia Extracción de ARN. Se homogeneizaron muestras de piel con Matriz D Usante, se extractaron los ARN' s totales usando el Equipo Totalmente ARN siguiendo las instrucciones del fabricante. 5. El ARN se eludió con 40 µl de agua libre de nucleasa.

Cuantificación del ARN. La cuantificación se realizó usando el Equipo de cuantificación de ARN Ribogreen® sobre charolas de 96 10 platinas y un lector de microplaca de fluorescencia de - acuerdo con el manual. Las mediciones se hicieron por duplicado. Las muestras fueron diluidas ya sea a 1:680 'ó a 1:3400 en un volumen final de regulador de 100 µl lxTE. Se . usaron como estándares las diluciones del ARN cromosomal de 15 1, 0.5, 0.1, 0.02, 0 µg/ml. La integridad de 1 µl de ARN fue controlada usando Nano Ensayo ARN 6000.

Tra nscripción inversa . Todas las manipulaciones se hicieron sobre hielo. 20. 2 µl de hexámeros aleatorios pd(N)d y 1 µl de dNTP (10 mM) fueron añadidos a 2 µg de ARN en agua libre de nucleasa en un volumen final de 12 µl. Después de 5 min de incubación a ' 65°C, las .muestras fueron inmediatamente colocadas sobre hielo y rápidamente centrifugadas. Luego, se añadieron 4 µl 25 de regulador de primer cordón 5X, 2 µl de ditiotreitol, 1 µl de inhibidor de RNasa y 1 µl de transcriptasa inversa SuperScript II RNasa H~ (volumen final de 20 µl) . La reacción de transcripción inversa se realizó en un ciclador PCR usando el siguiente programa de temperatura: activación de la enzima: 10 min a 25°C; reacción de transcripción inversa: 60 min a 42 °C; inhibición de la enzima: 20 min a 70°C. Luego la muestra fue mantenida en un congelador a - 20°C hasta su uso posterior.

Reacción en cadena de polimerasa en tiempo real . El PCR en tiempo real se realizó de acuerdo con el método TaqMan® en charolas de 96 platinas (96 P) usando sellador y sondas sobre pedido. El análisis se hizo por triplicado usando una mezcla maestra (3.5x) que contenia 43.7 µl de mezcla maestra PCR Universal TaqMan 2x, 4.4 ®1 de sellador y sondas sobre pedido, 21.9 µl de agua libre de nucleasa y 17.5 µl de cADN (87.5 ng = 25 ng por replicado). Los triplicados de 25 µl de muestra maestra se cargaron en una charola de reacción ABI PRISM de 96 platinas, cubierta con una cubierta adhesiva óptica transparente y centrifugada tres veces a 2000 rpm durante 1 min o hasta que todas las burbujas de aire fueron removidas. Luego se realizó la reacción PCR en el Sistema de Detección de Secuencia ABI PRISM® 7000 usando el siguiente programa de temperatura: activación de la enzima: 2 min a 50°C; desnaturalización: 10 min a 95°C y amplificación del blanco de 40 ciclos: 15 seg de recocido a 95°C y 1 min de extensión a 60 °C. El análisis de las gráficas de amplificación se hizo usando el software ABI PRISM®. . Los ajustes de la linea de base se hicieron individualmente (116: 15-25, Cdldl : 10-20, Pena: 15-25; Gapd: 6-15), mientras que los umbrales se establecieron manualmente a 0.2 para todos los selladores. Los valores Ct resultantes fueron exportados a Microsoft Excel para el análisis posterior.

Análisis estadístico. Los datos se analizaron con ANOVA.

Resultados y discusión. Los experimentos in vitro usando queratinocitos inmortalizados (HaCaT) , demostraron que el tratamiento con hesperetina (hp) y hesperetin-7-O-glucurónido (hp-7-0-gluc) reduce la muerte de las células bajo condiciones de cultivo normales. El efecto protector del hp y del hp-7-O-gluc fue aún más pronunciado en las células probadas con menadiona, un xenobiótico que aumenta .los niveles intracelulares de especies de oxigeno reactivo (ROS) . Además, el hp-7-0-gluc, principal metabolito de hesperidina en sangre, parece ser más potente comparado con el hp, la aglicona (Figura 1) .

El efecto protector de la hesperidina fue además investigado en un ensayo animal de intervención usando ratas wistar hembras en desarrollo. Después del destete, . las ratas se separaron aleatoriamente en 3 grupos con 12 animales cada uno y se suplementaron ya sea con una dieta de control, o con una dieta suplementada con hesperidina usando dos dosis diferentes (0.1% y 0.5%). A la edad de 12 semanas las ratas fueron sacrificadas y se usó tejido de la piel para la histología de piel y el análisis mARN (Figura • 2) . El análisis histopatológico de la piel reveló un número reducido de células inflamatorias en los animales alimentados con la dieta' de hesperidina. Las imágenes representativas se muestran en la Figura 3 (3A+D (control) vs 3B+É (0.1% de hesperidina) vs 3C+F (hesperidina)). Estas observaciones histológicas pudieron ser confirmadas al • nivel del mARN. La rata alimentada con 0.5% de hesperidina mostró niveles significativamente reducidos de IL-6, una citocina inflamatoria (Figura 4A+C) . Además, los niveles - CDldl de mARN fueron significativamente disminuidos en ambos grupos suplementados con hesperidina (Figura 4B+C) .

Estos datos demostraron claramente las propiedades citoptotectoras y antiinflamatorias para la piel de la hesperidina administrada oralmente.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Composición nutricional, cosmética o farmacéutica para administración oral, que contiene como ingrediente activo al menos un compuesto de flavanona o sus derivados, o una mezcla de los mismos, en una cantidad eficiente para prevenir, aliviar o tratar desórdenes de la piel, el cabello y/o el pelo.

2. Composición de acuerdo con la reivindicación 1, donde los compuestos de flavanona son isosacuranetina, naringina, hesperidina, eriodictiol, poncirina, neoeriocitrina .

3. Composición de acuerdo con la reivindicación 1, donde los derivados son las formas aglicona, chalcona, glicosilatadas o metiladas de la flavanona o las formas sulfatadas o - glucuronidatadas que son producto de. su metabolismo en sangre. -

4. Composición de acuerdo con la reivindicación donde el derivado se obtiene por tratamiento enzimático, o es producido sintéticamente.

5. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el compuesto de flavanona se extrae de la pulpa o de la cascara de frutas cítricas tales como naranja, limón, naranja agria o toronja.

6. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que contiene además otros compuestos activos tales como vitamina C, vitamina E, carotenoides, ubiquinones, catequinas, extractos de café • que contengan polifenoles y/o diterpenos, extractos de chicoria, extractos de gingko biloba, extractos de uva o de semilla de uva ricos en proantocianidinas, extractos de especias, extractos de soya, otras fuentes de flavonoides con actividad antioxidante, ácidos grasos, fibras prebióticas, microorganismos probióticos, taurina, ' resveratrol, aminoácidos, selenio 0 precursores de glutationa.

7. Composición de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es leche, yogurt, requesón, queso, leches fermentadas, productos fermentados con base de leche, helado, polvos con base de leche, fórmulas infantiles, productos de cereal, productos basados en cereal fermentado, agua mineral, chocolate o alimento para mascotas, suplementos dietéticos, tabletas o productos cosméticos.

8. Uso de al menos un compuesto de flavanona o de sus derivados, o una mezcla de los mismos, como ingrediente activo para la preparación de una composición diseñada para prevenir, aliviar o tratar desórdenes o daños de la piel, el cabello y/o el pelo. '

9. Uso de al menos un compuesto de flavanona o de sus derivados, o una mezcla de los mismos, como ingrediente activo para la preparación de una composición diseñada para mejorar las condiciones de la piel, el cabello y/o el pelo, cuando se administra a un humano o a un animal de mascota.

10. Uso de acuerdo con la reivindicación 8 ó 9, donde los compuestos de flavanona son isosacuranetina, naringina, hesperidina, eriodictiol, poncirina, neoeriocitrina o derivados seleccionados entre las formas aglicona, chalcona, glicosilatadas o metiladas y las formas sulfatadas y glucuronidatadas que son producto de su metabolismo en sangre.

11. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, donde el compuesto de flavanona se extrae de la pulpa o la cascara de frutos cítricos tales como naranja, limón, naranja agria o toronja.

12. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, donde la composición es una composición cosmética, nutricional o farmacéutica.

13. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, donde los compuestos de flavanona, sus derivados o mezclas de los mismos están presentes en una cantidad de desde 0.01 mg a 1 g, preferiblemente de 0.1 mg a 800 mg de equivalente de aglicona del compuesto de flavanona .

14. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13, donde los desórdenes o daños en la piel se producen por envejecimiento o una situación de estrés tal como estrés químico, biológico o físico, exposición a oxidantes o carcinógenos, a bacterias, virus, hongos, lípidos derivados de las células circundantes y/o microbios, o exposición a la irradiación UV.

15. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, donde la composición está diseñada para mejorar la fotoprotección, hidratación, sequedad, firmeza, elasticidad, oleosidad, grosor, pigmentación regular, función de barrera, elasticidad de la piel, para prevenir el estado oxidante, ' los riesgos de cáncer, inflamación o modular la producción o la .composición de sebo, y/o reducir los signos de envejecimiento.

16. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 14, donde la composición está diseñada para mejorar el brillo, densidad del cabello,, color,' oleosidad del cabello y el pelo, para mejorar el diámetro de la fibra de cabello, la producción de sebo, y para prevenir la pérdida de cabello y pelo.