MXPA02004599A - Tratamiento de tumores malignos de celula b utilizando anticuerpos anti-cd40l en combinacion con anticuerpos anti-cd20 y/o agentes quimioterapeuticos y radioterapia. - Google Patents

Abstract

La invencion describe composiciones, terapias de combinacion y metodos para tratar linfomas y leucemias de celulas B, asi como otros tumores malignos CD40+. El agente activo primario de la composicion es un anticuerpo anti-CD40L o un antagonista de CD40L que inhiba la interaccion de CD40-CD40L. Las composiciones pueden contener ademas, o utilizar, uno o mas de los siguientes en combinacion para el tratamiento de dicha enfermedad: anticuerpos anti-CD20, agentes quimioterapeuticos, cocteles para quimioterapia y radioterapia.

Description

TRATAMIENTO DE TUMORES MALIGNOS DE CÉLULA B UTILIZANDO ANTICUERPOS ANTI-CD40L EN COMBINACIÓN CON ANTICUERPOS ANTI- CD20 Y/O AGENTES QUIMIOTERAPÉUTICOS Y RADIOTERAPIA CAMPO DE LA INVENCIÓN La invención describe un método y terapia de combinación para tratar linfomas de célula B y leucemias, así como otros tumores malignos de CD40+, regulando la interacción entre CD40 y su ligando, CD40L, o regulando la señalización de CD40. De manera específica, se puede inhibir la interacción utilizando anticuerpos anti-CD40L para evitar que CD40L se una a CD40. Estos anticuerpos u otros agentes los cuales pueden inhibir la interacción CD40/CD40L también se pueden combinar con agentes quimioterapéuticos, radiación y/o anticuerpos anti-CD20 y anticuerpos anti-CD40.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Los linfomas son tumores de los linfocitos. El 90% de los linfomas se originan en las células B, y el 10% restante se originan en las células T. La mayoría de los pacientes se diagnostican con linfoma de la enfermedad de REF: 138803 Hodgkin (HD por sus siglas en inglés) o con linfoma de tipo no Hodgkin (NHL por sus siglas en inglés) . Dependiendo del linfoma que se diagnostique, las opciones de tratamiento incluyen radioterapia, quimioterapia, y el uso de anticuerpos monoclonales.

A. Anticuerpos anti-CD20 CD20 es un antígeno de superficie celular que se expresa en más de 90% de linfomas de célula B, la cual no se presenta o modula en las células neoplásicas (McLaughlin et al., J. Clin. Oncol. 16:2825-2833 (1998b)). El antígeno CD20 es una proteína de membrana de célula B de 35 kDa, no glucosilada, implicada en la señalización intracelular, la diferenciación de célula B y la movilización del canal de calcio (Clark et al., Adv. Cáncer Res. 52:81-149 (1989); Tedder et al., Immunology Today 15: 450-454 (1994)). El antígeno aparece como un marcador temprano del linaje de célula B de humano, y se expresa en forma ubicua en diversas densidades de antígeno tanto en poblaciones de células B normales como malignas. Sin embargo, el antígeno está ausente en célula B maduras, completamente (por ejemplo células plasmáticas) , en poblaciones de célula B tempranas y en células madre, lo que lo convierte en un objetivo apropiado para la terapia mediada con anticuerpo. Se han preparado anticuerpos anti-CD20 para ser utilizados tanto en investigación como en terapia. Un anticuerpo anti-CD20 es el anticuerpo monoclonal Bl (patente E.U.A. No. 5,843,398). También se han preparado anticuerpos anti-CD20 en forma de radionúclidos para tratar linfornas de célula B (por ejemplo, anticuerpo anti-CD20 marcado con 131I) , así como la forma marcada con 89Sr para aliviar el dolor de huesos ocasionado por la metástasis de cáncer de próstata y tejido mamario (Endo, Gan To Kagaku Ryoho 26:744-748 (1999) ) . Según se reporta se administró un anticuerpo monoclonal de múrido, IF5, (un anticuerpo anti-CD20) mediante infusión intravenosa continua a pacientes con linfoma de célula B. Sin embargo, se reporta que se requieren niveles extremadamente altos (> 2 gramos) de IF5 para reducir las células de tumor en circulación, y los resultados se describen como "transitorios" (Press et al., Blood 69: 584-591(1987)). Un problema potencial con el uso de anticuerpos monoclonales en terapia es que los anticuerpos monoclonales de tipo no humano (por ejemplo, anticuerpos monoclonales de múrido) típicamente carecen de la ' funcionalidad efectora de humano, por ejemplo, estos no LAJ.t.ii ^.t , i.fchftfa.... ~- ~j^ -?Z - .^? . ? * *>?.**»*.t>iix ¿Í? pueden, entre otras cosas, mediar la lisis dependiente de complemento o lisar células blanco de humano mediante la toxicidad celular dependiente de anticuerpo o la fagocitosis mediada por receptor Fc . Además, los anticuerpos monoclonales de tipo no humano pueden ser reconocidos por el hospedero humano como proteína extraña; por lo tanto, las inyecciones repetidas de tales anticuerpos extraños pueden conducir a la inducción de respuestas inmunes que lleven a reacciones de hipersensibilidad dañinas. Para los anticuerpos monoclonales con base de múrido, esto con frecuencia se conoce como una respuesta anti -anticuerpo de ratón de humano, o respuesta "HAMA" . En forma adicional, estos anticuerpos "extraños" pueden ser atacados por el sistema inmune del hospedero de tal manera que éstos, en efecto, son neutralizados antes de que lleguen al sitio objetivo .

RITUXAN® RITUXAN® (también conocido como Rituximab, MabThera®, IDEC-C2B8 y C2B8) fue el primer anticuerpo monoclonal aprobado por la FDA y fue desarrollado en IDEC Pharmaceuticals (véanse patentes E.U.A. Nos. 5,843,439; 5,776,456 y 5,736,137) para tratamiento del linfoma de célula B de humano (Ref. et al., Blood 83: 435-445 (1994)). RITUXAN® es un anti-CD20 monoclonal, quimérico (MAb) el cual es inhibidor del crecimiento y se reporta que sensibiliza ciertas líneas celulares de linfoma para la apoptosis mediante agentes quimioterapéuticos in vitro (Demidem et al., Cáncer Biotherapy & Radiopharmaceuticals 12: 177-(1997) ) . RITUXAN® también presenta actividad anti-tumor cuando se evalúa in vivo utilizando modelos animales de xenoinjerto de múrido. RITUXAN® según en forma eficiente al complemento de humano, tiene una unión fuerte a FcR, y puede aniquilar en forma eficiente linfocitos de humano in vitro mediante mecanismos dependientes de complemento (CDC) y mecanismos dependientes de anticuerpo (ADCC) (Reff et al . , Blood 83: 435-445 (1994)). En los macacos, el anticuerpo reduce en forma selectiva las células B normales de sangre y de los nodulos linfáticos. RITUXAN® se ha recomendado para el tratamiento de pacientes con linfoma de tipo no Hodgkin de célula B de grado bajo o folicular (McLaughlin et al . , Oncology (Huntingt) 12 : 1763-1777 (1998a); Maloney et al . , Oncology 12 : 63-76 (1998); Leget et al . , Curr. Opin . Oncol . 10 : 548-551 (1998) ) . En Europa, RITUXAN® ha sido aprobado para terapia de linfoma folicular en etapa III/IV de recaída (White et al . , Pharm . Sci . Technol . Today 2 : 95-101(1999)) y se reporta que es efectivo contra linfoma de célula central folicular (FCC) (Nguyen et al . , Eur. J. Haema tol 62: 76-82 (1999) ) . Otros trastornos tratados con RITUXAN® incluyen linfoma de célula central folicular (FCC) , linfoma de célula del manto (MCL) , linfoma de celular grande difusa (DLCL) , y leucemia linfocítica crónica/linforna linfocítico pequeño (SLL/CLL) (Nguyen et al . , 1999)). Se reporta que los pacientes con NHL refractaria o incurable han respondido a una combinación de RITUXAN® y terapias CHOP (por ejemplo, ciclofosfamida, vincristina, prednisona y doxorubicina) (Ohnishi et al . , Gan To Kagaku Ryoho 25: 2223-8 (1998)).

RITUXAN® una ha presentado toxicidad mínima y actividad terapéutica significativa en linfomas de tipo no Hodgkin de grado bajo (NHL) en estudios clínicos de fase I y II (Berinstein et al . , Ann . Oncol . 9: 995-1001 (1998)). RITUXAN®, el cual se utiliza sólo para tratar NHL de célula B a dosis semanales típicamente de 375 mg/m2 durante cuatro semanas con NHL refractario o de recidiva de grado bajo o folicular, se tolerarían y tiene actividad clínica significativa (Piro et al . , Ann . Oncol . 10:655-61 (1999); Nguyen et al . , (1999); y Coiffier et al . , Blood 92: 1927-1932 (1998) ) . Sin embargo, también se han administrado 1-..-UIMJ xn*iS£í<??^u*Jt.?¡ .„..« -1 i &«..t.? ...ifchdtafcatJat^j^aafc sL?- J¡ íí hasta 500 mg/m2 de cuatro dosis semanales durante pruebas utilizando el anticuerpo (Maloney et al . , Blood 90: 2188-2195 (1997)). RITUXAN® también se ha combinado con quimioterapéuticos, tales como CHOP (por ejemplo, ciclofosfamida, doxorubicina, vincristina y prednisona) , para tratar pacientes con linfoma de tipo no Hodgkin de célula B de grado bajo o folicular (Czuczman et al . , J. Clin . Oncol . 17: 268-76 (1999); and McLaughlin et al . , (1998a) ) .

B. CD40 y CD40L CD40 se expresa sobre la superficie celular de célula B maduras, así como en célula B leucémicas y linfocíticas, y en las células de Hodgkin y Reed-Sternberg (RS) de la enfermedad de Hodgkin (HD) (Valle et al . , Eur. J. I munol . 19: 1463-1467 (1989); and Gruss et al . , Leuk. Lymphoma 24: 393-422 (1997)). CD40 es un receptor de célula B que conduce a la activación y supervivencia de célula B normales y malignas, tales como el linfoma folicular de tipo no Hodgkin (Johnson et al . , Blood 82: 1848-1857 (1993); and Metkar et al . , Cáncer I inmuno 1 . Immunother. 47: 104 (1998)). La señalización a través del receptor de CD40 protege las células B inmaduras y los linfomas de célula B de la apoptosis inducida por IgM o Fas (Wang et al . , J. Immunology 155: 3722-3725 (1995)). De igual manera, las células de linfoma de célula de manto tienen un nivel elevado de CD40, y la adición de CD40L exógeno intensifica su supervivencia y las rescata de la apoptosis inducida por fludarabina (Clodi et al . , Bri t . J. Haematol . 103 : 217-219 (1998)). En contraste, otros han reportado que la estimulación de CD40 podría inhibir el crecimiento de célula B neoplásico tanto in vitro (Funakoshi et al . , Blood 83: 2787-2794 (1994)) como in vivo (Murphy et al . , Blood 86: 1946-1953 (1995)). Los anticuerpos anti-CD40 (véanse las patentes E.U.A. Nos. 5,874,082 y 5,667,165) administrados a ratones incrementan la supervivencia de ratones con linfomas de célula B de humano (Funakoshi et al . , (1994); and Tutt et al . , J. Immunol . 161: 3176-3185 (1998)). Los métodos para tratar neoplasmas, incluyendo linfomas de célula B y linfomas inducidos por EBV utilizando anticuerpos anti-CD40 imitan el efecto de CD40L y con lo cual suministran una señal de muerte, se describen en la patente E.U.A. No. 5,674,492 (1997), la cual se incorpora en la presente invención para referencia en su totalidad. La señalización de CD40 también se ha asociado con una interacción sinergística con CD20 (Ledbetter et al . , Circ . Shock 44: 67- A^MüAit..^fal?.JáAiA 72 (1994)). Las referencias adicionales que describen la preparación y uso de anticuerpos anti-CD40 incluyen las patentes E.U.A. Nos. 5,874,085 (1999), 5,874,082 (1999), 5,801,227 (1998) 5,674,492 (1997) y 5,667,165 (1997), las cuales se incorporan en su totalidad para referencia en la presente invención. Un ligando de CD40, gp39 (también llamado ligando CD40, CD40L ó CD154), se expresa en células CD4+Th activadas, pero no en descanso (Spriggs et al . , J. Exp . Med . 176: 1543-1550 (1992); Lañe et al . , Eur. J. I unol . 22: 2573-2578 (1992); and Roy et al . , J. Immunol . 151: 1-14 (1993)). Tanto CD40 como CD40L se han clonado y caracterizado (Stamenkovi et al . , EMBO J. 8: 1403-1410 (1989); Armitage et al . , Nature 357: 80-82 (1992); Lederman et al . , J. Exp . Med . 175: 1091-1101 (1992); and Hollenbaugh et al . , EMBOJ. 11 : 4313-4321 (1992)). El CD40L de humano también se describe en la patente E.U.A. No. 5,945,513. Las células transfectadas con del gen para CD40L y que expresan la proteína de CD40L en su superficie pueden inducir la proliferación de célula B, y junto con otras señales estimuladoras, pueden inducir la producción de anticuerpos (Armitage et al . , (1992); y patente E.U.A. No. 5,945,513).

CD40L puede desempeñar un papel importante en la interacción g^.-jMttt. *-.-^-^.-.r^^em^-*í^i*-u¡i- *Ádt-L?.. dependiente de contacto celular de las célula B de tumor (CD40+) dentro de los folículos neoplásicos de las células de Reed-Sternberg (CD40+) en áreas de la enfermedad de Hodgkin (Carbone et al . , Am . J. Pathol . 147: 912-922 (1995) ) . Se reporta que los anticuerpos monoclonales anti-CD40L se han utilizado en forma efectiva para inhibir la inducción de SIDA de múrido (MAIDS por sus siglas en inglés) en ratones infectados con LP-BM5 (Green et al . , Virology 241: 260-268 (1998)). Sin embargo, no es claro el mecanismo de la señalización de CD40L-CD40 que conduce a las respuestas de supervivencia contra muerte celular de las célula B malignas ofrecido por ejemplo, en las células de linfoma folicular, se han propuesto la regulación negativa de una molécula TRAIL que induce la apoptosis (AP0-2L) (Ribeiro et al . , Bri ti sh J. Haematol . 103: 684-689 (1998)) y la sobre expresión de BCL-2, y en el caso de B-CLL, la regulación negativa de CD95 (Fas/APO-1) (Laytragoon-Lewin et al . , Eur. J. Haematol . 61: 266-271 (1998)) como los mecanismos de supervivencia. En contraste, existe evidencia en el linfoma folicular, de que la activación de CD40 conduce a la regulación positiva de TNF (Worm et al . , International Immunol . 6 : 1883-1890 (1994)) moléculas CD95 (Plumas et al . , Blood 91: 2875-2885 (1998)). ^?-kfáJ^Í^?h-±.Jiá?i-t>.**j.** ,~,.*bu. »..^Aaa,,t..«A.,,a„i*_a>. ?.^b^,*^^.**^ ^.^? ^ *--l^-ff^, A .

También se han preparado anticuerpos anti-CD40 para prevenir o tratar enfermedades mediadas por anticuerpo, tales como las alergias y los trastornos autoinmunes como se describe en la patente E.U.A. No. 5,874,082 (1999). Se reporta que los anticuerpos anti-CD40 sean combinado en forma efectiva con anticuerpos anti-CD20 dando como resultado un efecto aditivo en la inhibición del crecimiento de linfomas de célula B de tipo no Hodgkin en cultivo celular (Benoit et al . , Immunopharmacology 35: 129-139 (1996) ) . Los estudios in vivo en ratones supuestamente demuestran que los anticuerpos anti-CD20 son más eficaces que los anticuerpos anti-CD40 administrados en forma individual para promover la supervivencia de ratones que portan algunas, pero no todas, las líneas de linfoma (Funakoshi et al . , J. Immunother. Emphasi s Tumor Immunol . 19: 93-101 (1996)). Se reporta que los anticuerpos anti-CD19 también son efectivos in vivo el tratamiento de todos linfomas de célula B de ratón singénico, BCL-1 y A31 (Tuff et al . (1998)) . También se han descrito los anticuerpos para CD40L para ser utilizados en el tratamiento de trastornos asociados con la activación de célula B (patente europea No. 555, 880 (1993)) . Los anticuerpos anti-CD40L incluyen anticuerpos monoclonales 3E4, 2H5, 2H8, 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 y 89-79, como se describe en la patente E.U.A. No. 5 ,7474 ,037 (1998), y los anticuerpos anti-CD40L descritos en la patente E.U.A. No. 5,876,718 (1999) utilizados para tratar la enfermedad de injerta contra hospedero. Por lo tanto, sin tomar en cuenta lo que se ha reportado previamente en la literatura, existe la necesidad de métodos mejorados de tratamiento y de terapias de combinación para tratar linfomas de célula B y leucemias. El uso de composiciones que contienen anticuerpos anti-CD40L, y de otros agentes que antagonizan las interacciones CD40-CD40L, ofrece otra vía de tratamiento para los pacientes con cáncer, las cuales pueden ser menos tóxicas que las terapias existentes. De manera específica, los métodos y composiciones propuestos para inhibir la estimulación de CD40 para prevenir que las células de cáncer se vuelvan refractarias a la muerte celular programada ocasionada por la quimioterapia y otras terapias para el cáncer, ofrece un método previamente desconocido para incrementar la terapia contra el cáncer y reducir el potencial de desarrollar células resistentes a la terapia BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN aáa=?#rit?f¡H -' T fil#ÉMl~ - •• ...«jfaaa.tte.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Es un objetivo de la invención proveer un método para tratar linfomas de célula B, leucemias de célula B, y otras tumoraciones malignas de CD40" que comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se una a CD40L. Los linfomas de célula B incluyen linfoma de Hodgkin y linfomas de tipo no Hodgkin de cualquier grado. Otro objetivo de la invención es proveer una terapia de combinación para el tratamiento de linfoma de célula B o una leucemia de célula B que comprende un anticuerpo o un fragmento de anticuerpo anti-CD40L o antagonistas para CD40L y por lo menos uno de los siguientes (a) un agente quimioterapéutico o una combinación de agentes quimioterapéuticos, (b) radioterapia, (c) un anticuerpo anti-CD20 o fragmento del mismo y (d) un anticuerpo anti- CD40 o fragmento del mismo.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 muestra la sensibilidad de las células de linfoma B a la adriamicina después de 4 horas de exposición .

La figura 2 (panel A) muestra que anti-CD40L (IDEC-131) anula la resistencia mediada por CD40L a la aniquilación mediante ADM de linfoma de célula B. (Panel B) muestra el efecto de RITUXAM® sobre células DHL-4 normales y previamente tratadas con sCD40L. La figura 3 (panel A) muestra el bloqueo de la supervivencia celular mediada por CD40L de B-CLL mediante el anticuerpo anti-CD40L (IDEC-131) . (Panel B) muestra el bloqueo de la supervivencia celular mediada por CD40L de B-CLL mediante C2B8 de IDEC. La figura 4 muestra el análisis FACS que compara la expresión de HLA-DR en células CD19+ CLL cultivadas con SCD40L y células que no se cultivan con SCD40L.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Otro aspecto de la invención es proveer una composición para el tratamiento de leucemias y lmfornas, así como de otros tumores malignos que expresen a CD40. Una modalidad preferida de la invención, son las composiciones y métodos para su uso para tratar linfomas y leucemias del linaje de célula B. Las composiciones pueden comprender agentes, que antagoniza la señalización de CD40 o la jliAaAAl-Aj fcasi-aMBa».»....^.ái aás^iiia^..,teÍSM^ **- -¿¿*Í?á?. áiJ.*l? * interacción entre CD40 y CD40L. En forma opcional, los agentes pueden comprender un agente activo, tal como un anticuerpo anti-CD40L o fragmento del mismo, así como fragmentos de péptido, peptidomiméticos, o compuestos químicos. En forma alternativa, la composición puede comprender agentes activos múltiples, los cuales seleccionan como blanco aspectos del tumor maligno diferentes a la señalización de CD40 o a la interacción CD40/CD40L, tales como agentes quimioterapéuticos, otros anticuerpos, y/o que se pueden administrar en combinación con terapia de radiación.

A. Definiciones El término "anticuerpo para CD40L" tal como se utiliza en la presente invención, pretende incluir inmunoglobulinas y fragmentos de las mismas que reaccionan en forma específica con una proteína CD40L o un péptido de la misma o una proteína de fusión de CD40L. Los anticuerpos para CD40L pueden incluir anticuerpos de humano, anticuerpos primatizados , anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos y anticuerpos humanizados. Con el término "anticuerpo para CD40" tal como se utiliza en la presente invención, se pretende incluir inmunoglobulinas y fragmentos de las mismas que reaccionan en forma específica con una proteína CD40 o un péptido de la misma o una proteína de fusión de CD40. Los anticuerpos para CD40 pueden incluir anticuerpos de humano, anticuerpos primatizados , anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos y anticuerpos humanizados. Con el término "anticuerpo para CD20" tal como se utiliza la presente invención, se pretende incluir inmunoglobulinas y fragmentos de las mismas que reaccionan en forma específica con una proteína CD20 o un péptido de la misma o una proteína de fusión de CD20. Los anticuerpos para CD20 pueden incluir anticuerpos de humano, anticuerpos primatizados, anticuerpos quiméricos, anticuerpos biespecíficos y anticuerpos humanizados. Los anticuerpos anti-CD20 incluyen el anticuerpo monoclonal Bl y RITUXAN®. Con el término "anticuerpo humanizado" se quiere decir un anticuerpo derivado a partir de un anticuerpo no humano, típicamente un anticuerpo de múrido, que conserva o que sustancialmente conserva las propiedades de unión a antígeno del anticuerpo progenitor, pero que es menos inmunogénico en humanos . Esto se puede lograr mediante varios métodos, incluyendo (a) injertar los dominios variables no humanos completos en las regiones constantes de humano para generar anticuerpos quiméricos; (b) injertar solamente las regiones determinantes de complementariedad no humanas (CDR por sus siglas en inglés) en el marco de humano y las regiones constantes con o sin retención de los residuos de marco críticos; y (c) trasplantar los dominios variables no humanos completos, pero "envolviéndolos" con una sección de tipo humano reemplazando los residuos de superficie. Tales métodos se describen en Morrison et al . , Proc . Nati . Acad. Sci. 81: 6851-5 (1984); Morrison et al . , Adv. Immunol . 44: 65-92 (1988); Verhoeyen et al . , Science 239: 1534-1536 (1988); Padlan, Molec . Immun . 28: 489-498 (1991); and Padlan, Molec . Immun . 31: 169-217 (1994), de las cuales todas se incorporan en la presente invención para referencia en su totalidad. Los anticuerpos anti-CD40L humanizados se pueden preparar como se describe en la solicitud de patente E.U.A. No. 08/554,840 presentada el 7 de noviembre de 1995 también incorporada en la presente invención para referencia en su totalidad. Con el término "anticuerpo humano" se quiere decir un anticuerpo que contiene las cadenas ligera y pesada de humano " completamente así como las regiones constantes, producidas mediante cualquiera de los métodos normales conocidos .

Con el término "anticuerpo primatizado" se quiere decir un anticuerpo recombinante que ha sido manipulado genéticamente para que contenga los dominios variables ligero y pesado de un anticuerpo de mono (o de otro primate), en particular, un anticuerpo de mono cinomolgus, y que contiene las secuencias para los dominios constantes de humano, de preferencia el dominio constante de inmunoglobulina gamma 1 o gamma 4 (o la variante PE) . La preparación de tales anticuerpos se describe en Newman et al . , Biotechnology, 10 : 1458-1460 (1992); también en las solicitudes cedidas en común 08/379,072, 08/487,550 o 08/746,361, de las cuales todas se incorporan para referencia en su totalidad en la presente invención. Se ha reportado que estos anticuerpos presentan un grado elevado de homología con anticuerpos humanos, es decir, 85-98% presentan funciones efectoras de humano, tienen carácter de inmunogénico reducido, y pueden presentar una afinidad elevada para los antígenos humano. Con el término "fragmento de anticuerpo" se quiere decir un fragmento de un anticuerpo tal como Fab, F(ab')2, Fab' y scFv. Con el término "anticuerpo quimérico" se quiere decir un anticuerpo que contiene secuencias derivadas de los anticuerpos diferentes, las cuales típicamente son de especies diferentes. Por lo general, los anticuerpos quiméricos comprenden fragmentos de anticuerpo de humano y de múrido, y generalmente las regiones constante de humano y variables de múrido. Con el término "anticuerpo biespecífico" se quiere decir una molécula de anticuerpo con un sitio de unión a antígeno específico para un antígeno, y con el otro sitio de unión a antígeno específico para otro antígeno. Con el término "carácter inmunogénico" se quiere decirla capacidad de una proteína una porción terapéutica para selección de blanco para provocar una respuesta inmune (por ejemplo humoral o celular) cuando se administra a un individuo . Es especialmente conveniente formular composiciones parenterales en formas de dosificación unitaria para facilidad de administración y uniformidad de la dosis. "Forma de dosificación unitaria", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a unidades físicamente independientes apropiadas como dosis unitarias para los individuos mamíferos que serán tratados; cada unidad contiene una cantidad predeterminada que está calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Las especificaciones para las formas de dosificación unitaria de la invención quedan determinadas por y dependen directamente de: (A) las características cómicas del compuesto activo y del efecto terapéutico particular que se quiere lograr; y (B) las limitaciones inherentes en la técnica para mezclar tal compuesto activo para el tratamiento de la sensibilidad en individuos .

B. Antagonistas de CD40L De conformidad con los métodos de la invención, se administra un antagonista de CD40L a un individuo para interferir con la interacción de CD40L y su compañero de unión, CD40. Un "antagonista de CD40L" se define como una molécula que interfiere con esta interacción. El antagonista para CD40L puede ser un anticuerpo dirigido contra CD40L (por ejemplo un anticuerpo monoclonal contra CD40L) , un fragmento o derivado de un anticuerpo contra CD40L (por ejemplo los fragmentos Fab o F(ab)'2,) anticuerpos quiméricos o anticuerpos humanizados, formas solubles de CD40, formas solubles de una proteína de fusión que comprende CD40, o agentes farmacéuticos que alteran o que interfieren con la interacción CD40L-CD40 o que interfieren . »M^JiMaA¡Mte^B>*?^J-^Jta-AA^a.»,At^at-- ¡ con la señalización de CD40.

Anticuerpos Para preparar anticuerpos anti-CD40L, se puede inmunizar un mamífero (por ejemplo un ratón, hámster, conejo o ungulado) con una forma inmunogénica de la proteína CD40L o fragmento de proteína (por ejemplo fragmento de péptido) , que provoque una respuesta de anticuerpo en el animal. También se puede utilizar una célula que exprese a CD40L sobre superficie como un inmunógeno. Los inmunógenos alternativos incluyen la proteína o fragmentos de proteína CD40L. CD40L se puede purificar a partir de células que exprese a CD40L utilizando técnicas de purificación estándar (Armitage et al . , (1992); Lederman et al . , (1992); and Hollenbaugh et al . , (1992)). De manera alternativa, se pueden preparar péptidos de CD40L tomando como base la secuencia de aminoácidos de CD40L, como la descrita en Armitage et al., (1992) . Las técnicas para conferir carácter inmunogénico en una proteína incluyen conjugación a vehículos u otras técnicas bien conocidas en el campo. Por ejemplo, la proteína se puede administrar en presencia de un adyuvante. El procedimiento de inmunización se puede monitorear detectando los títulos de anticuerpo en plasma o suero. Se pueden utilizar pruebas ELISA estándar u otras pruebas inmunológicas con el inmunógeno como el antígeno para evaluar los niveles de anticuerpos. Después de la inmunización, se puede tener antisuero y aislar los anticuerpos policlonales. Para producir anticuerpos monoclonales, se pueden cosechar células productoras de anticuerpo y se fusionan con células de mieloma utilizando procedimientos de fusión de célula somática estándar, como los descritos en las patentes E.U.A. Nos. 5,833,987 (1998) y 5,747,037 (1997) . Los anticuerpos pueden ser fragmentos utilizando técnicas convencionales, y los fragmentos se seleccionan respecto a su utilidad en la misma forma descrita anteriormente para anticuerpos enteros. Por ejemplo, se pueden generar fragmentos F(ab')2 tratando el anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab')2 resultante se puede tratar para reducir los puentes de disulfuro para producir fragmentos Fab' . Otros fragmentos de anticuerpo contemplados incluyen Fab y scFv. Un método para reducir al mínimo reconocimiento de los anticuerpos no humanos cuando se utilizan en forma terapéutica en humanos, diferente de la inmunosupresión general, es producir derivados de anticuerpo quimérico, es decir moléculas de anticuerpo que combinan una región variable de animal no humano y una región constante -de humano. Las moléculas de anticuerpo quimérico humanizadas pueden incluir, por ejemplo, el dominio de unión a antígeno proveniente de un anticuerpo de un ratón, rata u otra especie, con las regiones constantes de humano. Los métodos para preparar estos anticuerpos quiméricos humanizados incluyen aquellas referencias citadas en la patente E.U.A. No. 5, 833, 987 (1998) . Para propósitos terapéuticos en humanos, los anticuerpos que reaccionan en forma específica con una proteína o péptido de CD40L también se pueden humanizar produciendo quimeras de la región variable de humano, en cuyas partes de las regiones variables, en especial las regiones de marco conservadas del dominio de unión a antígeno, son de origen humano y únicamente las regiones hipervariables son de origen no humano. Tales moléculas de inmunoglobulinas alteradas se pueden preparar mediante cualquiera de varias técnicas conocidas en el campo, (por ejemplo, Teng et al . , Proc . Nati . Acad . Sci . U.S.A. 80: 7308-7312 (1983); Kozbor et al., Immunology Today 4 : 7279 (1983); Olsson et al . , Meth . Enzymol. 92: 3-16 (1982)), y de preferencia se preparan de conformidad con las enseñanzas de la publicación WO 92/06193 del PCT o la patente EP 0239400. Los anticuerpos humanizados se pueden producir comercialmente por, por ejemplo, Scotgen Limited, 2 Holly Road, Twickenham, Middlesex, Gran Bretaña. Un anticuerpo gp39 (CD40L) humanizado preferido, IDEC-131, se describe en la solicitud de patente E.U.A. No. cedida 08/554,840, incorporada para referencia en su totalidad en la presente invención. Otro método para generar anticuerpos específicos, o fragmentos de anticuerpo, que reaccionen contra una proteína o péptido CD40L (por ejemplo tal como la proteína de fusión gp39 descrita en la patente E.U.A. No. 5,945,513) es seleccionar genotecas de expresión que codifican para genes de inmunoglobulina, o porciones de los mismos, expresados en bacterias con una proteína o péptido CD40L. Por ejemplo, se pueden expresar los fragmentos Fab, las regiones VH y las regiones Fv en bacterias utilizando genotecas de expresión de fago. Véase por ejemplo, Ward et al . , Nature 341: 544546 (1989); Huse et al . , Science 246: 1275-1281 (1989); and McCafferty et al . , Na ture 348: 552-554 (1990) . La selección de tales genotecas con, por ejemplo, un péptido CD40L, puede identificar fragmentos de inmunoglobulina que reaccionan con CD40L. De manera alternativa, se puede utilizar SCID-hu ratón (disponible de Genpharm) para producir anticuerpos o fragmentos del mismo. Las metodologías para producir anticuerpos monoclonales (MAb) dirigidos contra CD40L, incluyendo CD40L de humano y CD40L de ratón, y los anticuerpos monoclonales apropiados para ser utilizados en los métodos de la invención, se describen en la solicitud de patente No. WO 95/06666 del PCT titulada "Anti-gp39 Antibodies and Uses Therefor" ; cuyas enseñanzas se incorporan en la presente invención para referencia en su totalidad. Los anticuerpos ant?-CD40L de humano particularmente preferidos de la invención son MAbs 24-31 y 89-76, producidos respectivamente por los hibpdomas 24-31 y 89-76. Los hibridomas 89-76 y 24-31, que producen los anticuerpos 89-76 y 24-31, respectivamente, se depositaron bajo las condiciones del tratado de Budapest en el Depósito Americano de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Blvd. , Manassas, VA 20110-2209, el 2 de septiembre de 1994. Al hibridomas 89-76 se le asignó el número de acceso ATCC HB11713 y al hibridomas 24-31 se le asignó el número de acceso ATCC HB11712. Se pueden producir anticuerpos anti-CD40L recombinantes, tales como los anticuerpos quiméricos y humanizados, manipulando un ácido nucleico (por ejemplo ADN ía. ^.^.^ ^. í .-, ftftff». o ADNc) que codifica para un anticuerpo anti-CD40L de conformidad con técnicas de ADN recombinante estándar. Por consiguiente, otro aspecto de esta invención pertenece a moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican para las cadenas pesada o ligera de la inmunoglobulina, o porciones de las mismas, que reaccionan con CD40L, en particular CD40L de humano. El ácido nucleico que codifica para inmunoglobulina puede codificar una región variable de la cadena ligera (VL) o la cadena pesada (VH) de inmunoglobulina, con o sin una región constante de la cadena pesada o ligera ligada (o porción de la misma) . Tales ácidos nucleicos se pueden aislar a partir de una célula (por ejemplo hibridoma) que produzca un MAb anti-CD40L de humano mediante técnicas estándar. Además, se pueden incorporar los ácidos nucleico se codifican para un MAb anti-CD40L de humano en un vector de expresión e introducir en una célula hospedera apropiada para facilitar la expresión y producción de las formas recombinantes de los anticuerpos anti-CD40L de humano .

Anticuerpos primatizados Otros medios bastante eficientes para generar anticuerpos recombinantes son descritos por Newman, Biotechnology, 10: 1455-1460 (1992). De manera más particular, esta técnica da como resultado la generación de anticuerpos primatizados los cuales contienen los dominios variables de mono y las secuencias constantes de humano. Esta referencia se incorpora para referencia en su totalidad en la presente invención. Además, esta técnica también se describe en la solicitud E.U.A. No. 08/379,072, cedida en forma común, presentada el 25 de enero de 1995, la cual es una continuación de la solicitud E.U.A. número de serie 07/912,292, presentada el 10 de julio de 1992, la cual es una continuación en parte de la solicitud E.U.A. No. de Serie 07/856,281, presentada el 23 de marzo de 1992, la cual es finalmente una continuación en parte de la solicitud E.U.A. No. de Serie 07/735,064, presentada el 25 de julio de 1991. 08/379,072 y la solicitud precursora de las mismas los cuales se incorporan todas para referencia en su totalidad en la presente invención. Esta técnica modifica los anticuerpos de tal manera que éstos ya no son rechazados antigénicamente después de administrarlos en humanos. Esta técnica se basa en la inmunización de monos cinomolgus con antígenos o receptores de humano. Esta técnica se desarrolló para crear anticuerpos monoclonales de alta afinidad dirigidos a los antígenos de superficie de célula de humano. La identificación de anticuerpos de macaco para CD40L de humano mediante selección de genotecas de despliegue de fago o de heterohibridomas de mono obtenidos utilizando linfocitos B provenientes de monos inmunizados con CD40L se puede efectuar utilizando los métodos descritos en la solicitud E.U.A No. 08/487, 550, cedida en forma mancomunada, presentada el 7 de junio de 1995, incorporada en la presente invención en su totalidad para referencia. Se ha reportado previamente que los anticuerpos generados utilizando los métodos descritos en estas solicitudes despliegan la función efectora de humano, tienen carácter inmunogénico reducido, y una vida media prolongada en suero. La tecnología se basa en el hecho que a pesar del hecho de que los monos cinomolgus son filo genéticamente similares a los humanos, éstos siguen reconociendo muchas proteínas de humano, extrañas y por lo tanto presentado una respuesta inmune. Además, debido a que los monos cinomolgus son filo genéticamente cercanos a los humanos, se ha descubierto que los anticuerpos generados en estos monos tienen un grado elevado de homología de aminoácidos con aquellos producidos en humanos. En efecto, después de determinar la secuencia de los genes para las regiones variables de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina de macaco, se encontró que la secuencia de cada familia de gen tiene 85-98% de homología con su contraparte de humano (referencia) . El primer anticuerpo generado en esta manera, un anticuerpo anti-CD4, tiene 91-92% de homología con la secuencia de consenso de las regiones de marco de la inmunoglobulina de humano (Newman et al., 1992) . Como se describió anteriormente, la presente invención se refiere, en parte, a la identificación de anticuerpos monoclonales o las formas primatizados de los mismos los cuales son específicos para el antígeno de CD40L de humano y que puedan inhibir la señalización de CD40 o que puedan inhibir la interacción de CD40/CD40L. El bloqueo del sitio de activación primaria entre CD40 y CD40L con los anticuerpos identificados (o los fragmentos terapéuticamente efectivos de los mismos) , mientras que al mismo tiempo se permite el efecto antagonístico combinado sobre la co-estimulación positiva con un efecto agnóstico sobre la señalización negativa, será un método terapéutico o útil para intervenir en las formas de recidiva de tumoración maligna, en especial de linfomas y leucemias de célula B. La * m*.rj»?a***j tf?- r}&itf1í ?,, iffflfi i- - ... t^toa actividad funcional de los anticuerpos identificados se define bloqueando las señales de CD40 que permiten la supervivencia y evitan la apoptosis inducida por IgM o por Fas. La fabricación de anticuerpos monoclonales de mono novedosos que se unan en forma específica a CD40L o CD40 de humano, así como los anticuerpos primatizados derivados de los mismos se puede efectuar utilizando los métodos descritos en la solicitud E.U.A. co-pendiente No. de serie 08/487,550, y como se indica en la presente invención. Estos anticuerpos poseen una afinidad elevada para CD40L y por lo tanto se pueden utilizar como inmunosupresores que inhiban la ruta de CD40L/CD40. La preparación de anticuerpos monoclonales de mono de preferencia se efectúa seleccionando genotecas de despliegue de fago o preparando heterohibridomas de mono utilizando linfocitos B obtenidos a partir de monos inmunizados con CD40L (por ejemplo CD40 de humano) . El CD40 de humano también puede provenir de la proteína de fusión descrita en la patente E.U.A. No. 5,945,513. Como se indicó, el primer método para generar anticuerpos anti-CD40L implica tecnología de despliegue de fago recombinante. Esta técnica se describe en forma general MÍ, -?* *-*-.-.-a¡tJ¡>u*.?» . jMiMjaAj«-». -^f*" -H -* •* it*(aA| fc supra . Esencialmente, esta comprende la síntesis de genotecas de inmunoglobulina recombinante contra el antígeno de CD40L desplegado en la superficie de fagos filamentosos y la selección de fagos que secretan anticuerpos que tienen una afinidad elevada para el antígeno de CD40L. Como se indicó supra, de preferencia se seleccionan anticuerpos que se unan tanto a CD40L como a CD40 de humano. Para efectuar tal metodología, los inventores de la presente invención han creado una genoteca única para genotecas de mono se reduce la posibilidad de recombinación y mejora la estabilidad. En esencia, para adoptar el despliegue de fago para ser utilizado con genotecas de macaco, este vector contiene iniciadores específicos para amplificar mediante PCR los genes para inmunoglobulina de mono. Estos iniciadores se basan en secuencias de macaco obtenidas mientras se desarrollan la tecnología y las bases de datos primatizadas que contienen secuencias de humano. Los iniciadores apropiados se describen en el documento 08/379,072, cedido en forma mancomunada, incorporado para referencia en la presente invención. El segundo método implica la inmunización de monos, es decir, macacos, contra el antígeno de CD40L de -?S*?á*? «,Mt *A e.*^? AÉ. - , Í humano. La ventaja inherente de los macacos para la generación de anticuerpos monoclonales se discute supra. En particular, tales monos, es decir monos cinomolgus, se pueden inmunizar contra antígenos o receptores de humano. Además, los anticuerpos resultantes se pueden utilizar para preparar anticuerpos primatizados de conformidad con la metodología de New an et al., (1992), y Newman et al., solicitud de patente E. U. A. No. de serie 08/379, 072, presentada el 25 de enero de 1995, la cual se incorpora para referencia en su totalidad en la presente invención. La ventaja significativa de los anticuerpos obtenidos a partir de monos cinomolgus es que estos monos reconocen muchas proteínas de humano como extrañas y por lo tanto aseguran la formación de anticuerpos, algunos con una afinidad elevada hacia los antígenos de humano deseados, por ejemplo, las proteínas de superficie y los receptores de célula de humano. Además, debido a que estos son filogenéticamente cercanos a los humanos, los anticuerpos resultantes presentan un grado elevado de homología de aminoácidos con aquellos producidos en humanos. Como se indicó anteriormente, después de determinar la secuencia de los genes para las regiones variables ligera y pesada de la inmunoglobulina de macaco, se encontró que la secuencia de cada familia de gen tiene 85-88% de homología con su contraparte de humano (Newman et al., 1992). Esencialmente, a los monos macacos cmomolgus se les administra antígeno de CD40L de humano, se aislan las célula B de los mismos, por ejemplo se toman biopsias de nodulo linfático a partir de los animales, y los linfocitos B se fusionan después con células de heteromieloma KH6/B5 (ratón x humano) utilizando polietilenglicol (PEG) . Después se identifican los heterohibridomas que secretan anticuerpos que se unen al antígeno de CD40L de humano. Son deseables los anticuerpos que se unen a CD40L o a CD40 en una forma que interrumpa o regule la señalización de CD40, debido a que tales anticuerpos se pueden utilizar potencialmente para inhibir la interacción de CD40L con CD40, con sus contra-receptores. Si se pudieran desarrollar anticuerpos contra más de un epítope en CD40L o CD40, y los anticuerpos se utilizarán juntos, su actividad combinada podría brindar potencialmente efectos sinergísticos . La invención descrita implica el uso de un animal que está cebado para producir un anticuerpo particular (por ejemplo primates, tales como orangután, babuinos, macacos y monos cinomolgus) . Otros animales que podrían ser utilizados para crear anticuerpos para CD40L de humano incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: ratones, ratas, cobayos, hámsters, monos, cerdos, cabras y conejos. Los medios preferidos para generar anticuerpos de humano utilizando ratones SCID se describen en la solicitud de patente E.U.A. co-pendiente No. de serie 08/488,376 de propiedad mancomunada. Se han clonado los genes humanos que codifican para los antígenos de CD40, CD40L y CD20 y se les ha determinado su secuencia, y por lo tanto, se pueden fabricar fácilmente utilizando métodos recombinantes. De preferencia, los antígenos de CD40, CD40L y CD20 de humano se administran en forma soluble, por ejemplo, mediante la expresión del gen que codifica para el antígeno, el cual tiene sus dominios de transmembrana y citoplásmico removidos, con lo cual se deja únicamente la porción extracelular, es decir los dominios tipo V y C de la superfamilia extracelular. Los macacos se inmunizan con el antígeno de CD40L, de preferencia una forma soluble del mismo, bajo condiciones que den como resultado la producción de anticuerpos específicos para el mismo. De preferencia, el antígeno soluble de CD40L de humano se administra en combinación con un adyuvante, por ejemplo el Adyuvante Completo de Freund (CFA por sus siglas en inglés) , alumbre, saponina, u otros adyuvantes conocidos, así como combinaciones de los mismos. En general, esto requiere la inmunización repetida, por ejemplo, mediante inyección repetida, en un lapso de varios meses. Por ejemplo, la administración de antígeno soluble de CD40L de humano se efectúa en adyuvante, con inmunizaciones de refuerzo, a lo largo de un periodo de 3 a 4 meses, con la producción resultante de suero que contiene anticuerpos que se unen al antígeno de CD40L de humano. Después de la inmunización, se recolectan las célula B, por ejemplo mediante biopsias de nodulo linfático tomadas a partir de animales inmunizados, y los linfocitos B se fusionan con células de heteromieloma KH6/B5 (ratón x humano) utilizando polietilenglicol. Los métodos para la preparación de tales heteromielomas son conocidos y se pueden encontrar en la solicitud E.U.A. No. de serie 08/379, 072 para Newman et al., presentada el 25 de enero de 1995 e incorporada en la presente invención para referencia Después se identifican los heterohibridomas que secretan anticuerpos que se unen al antígeno de CD40L de humano. Esto se puede efectuar mediante técnicas conocidas. Por ejemplo, esto se puede determinar mediante ELISA o pruebas radio ..... ,.^diJ»)Lx*»fajfcJifa.. ^.A.¿, ria^^ .* , **-*& Aa^i inmunológicas utilizando antígeno de CD40L de humano marcado con enzima o con radio nucleótido. Después las líneas celulares que secretan anticuerpos que tienen la especificidad deseada para el antígeno de CD40L de humano se subclonan hasta que se tornan monoclonales . Las líneas celulares que expresan anticuerpos que se unen en forma específica al antígeno de CD40L de humano se utilizan después para clonar las secuencias para el dominio variable para la fabricación de anticuerpos primatizados como se describe esencialmente en Newman et al., (1992) y en Newman et al., solicitud E.U.A. No. de serie 379, 072, presentada el 25 de enero de 1995, de las cual es ambas se incorporan para referencia en la presente invención. Esencialmente, esto implica la extracción de ARN de las mismas, la conversión a ADNc, y la amplificación del mismo mediante PCR utilizando iniciadores específicos para Ig. Los iniciadores apropiados se describen en Newman et al., 1992, y en la solicitud E.U.A. No. de serie 379, 072. Los genes variables clonados de mono se insertan después en un vector de expresión que contiene los genes para la región constante de la cadena pesada y ligera de humano. De preferencia, esto se efectúa utilizando un vector de expresión de marca registrada de IDEC, Inc., conocido como NEOSPLA. Este vector contiene el promotor/intensificador de citomegalovirus, el promotor mayor de beta globina de ratón, el origen de replicación de SV40, la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento de bovino, el exón 1 y el exón 2 de la neomicina fosfotransferasa, la región constante kappa o lambda de la inmunoglobulina de humano, el gen para dihidrofolato reductasa, región constante PE y la secuencia líder para la inmunoglobulina gamma 1 o gamma 4 de humano. Se ha encontrado que este vector da como resultado un nivel de expresión muy alto de anticuerpos primatizados después de incorporar los genes para la región variables de mono, transfección en células CHO, seguido por selección en medio que contiene G418 y amplificación con metotrexato. Por ejemplo, se ha descrito previamente que este sistema de expresión de amor resultado anticuerpos primatizados que tienen una avidez elevada (Kd < 10"10 M) contra CD4 y otros receptores de superficie celular de humano. Además, se ha encontrado que los anticuerpos presentan la misma afinidad, carácter específico y actividad funcional que el anticuerpo de mono original. Este sistema de vector se describe sustancialmente en la solicitud E. U. Í<faJüaULJaA< dUf >. ~..~*J¡ t * A. No. de serie 370 de, 072, cedida en forma mancomunada, incorporada para referencia en la presente invención así como la solicitud E. U. A. No. de serie 08/149, 099, presentada el 3 de noviembre de 1993, también incorporada para referencia en su totalidad en la presente invención. Este sistema asegura niveles de expresión altos, es decir, > 30 pg/células/día. La cantidad de anticuerpo útil para producir un efecto terapéutico se puede determinar utilizando técnicas estándar bien conocidas por los expertos en la técnica. Los anticuerpos por lo general serán provistos mediante técnicas estándar dentro de una solución reguladora farmacéuticamente aceptable, y se puede administrar mediante cualquier ruta deseada. Debido a la eficacia de los anticuerpos reclamados mediante la presente invención y a su tolerancia por humanos es posible administrar estos anticuerpos en forma repetitiva con el fin de combatir diversas enfermedades o estados patológicos dentro de un humano. Un experto en la técnica podrá, mediante experimentación de rutina, determinar cuál será la cantidad de anticuerpo efectiva, no tóxica para el propósito de inducir la inmunosupresión. Sin embargo, por lo general una dosis efectiva estará en el intervalo de 0.05 aproximadamente hasta 100 mg por kilogramo de peso corporal por día. Los anticuerpos (o fragmentos de los mismos) de esta invención también deben ser útiles para tratar tumores en un mamífero. De manera más específica, estos debe ser útiles para reducir el tamaño de tumor, inhibir el crecimiento de tumor y/o prolongar el tiempo de supervivencia de los animales que llevan el tumor. Por consiguiente, esta invención también se refiere a un método para tratar tumores en un humano o en otro animal administrando a tal humano o animal una cantidad efectiva, no tóxica de un anticuerpo. Un experto en la técnica puede, mediante experimentación de rutina, determinar cuál es la cantidad efectiva, no tóxica de un anticuerpo anti-CD40L para el propósito de tratar tumores carcinogénicos . Sin embargo, en general se espera que una dosis efectiva esté en el intervalo de 0.05 a 100 mg por kilogramo de peso corporal por día. Los anticuerpos de la invención se pueden administrar a un humano o a otro animal de conformidad con los métodos de tratamiento antes mencionados en una cantidad suficiente para producir dicho efecto hasta un grado terapéutico o profiláctico. Tal es anticuerpos de la invención se pueden administrar a un humano u otro animal en una forma de dosificación convencional que se prepara combinando el anticuerpo de la invención con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable convencional de conformidad con técnicas conocidas. El experto de la técnica reconocerá que la forma y carácter del vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable quedan determinados por la cantidad de ingrediente activo con el cual se va a combinar, las vías de administración y otras variables bien conocidas. La vía de administración del anticuerpo (o fragmento del mismo) de la invención puede ser oral, parenteral, mediante inhalación o tópica. El término parenteral tal como se utiliza en la presente invención incluye la administración intravenosa, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, rectal o vaginal. Por lo general se prefieren las formas subcutánea e intramuscular de administración parenteral . Los regímenes de dosificación parenteral y oral diarios para emplear los compuestos de la invención para inducir la inmunosupresión en forma profiláctica o terapéutica, o para tratar terapéuticamente los tumores carcinogénicos estarán por lo general en el intervalo de 0.05 aproximadamente hasta 100, pero de preferencia entre 0.5 o a 10 mg aproximadamente por kilogramo de peso corporal por día. Los anticuerpos de la invención también se pueden administrar mediante inhalación. Mediante "inhalación" se quiere decir la administración intranasal y la inhalación oral . Las formas de dosificación apropiadas para tal administración, tal como una formulación en aerosol o inhalador de dosis medida, se pueden preparar utilizando técnicas convencionales. La cantidad de dosis preferida de un compuesto de la invención que será empleado, por lo general está dentro del intervalo de 10 a 100 mg aproximadamente . Los anticuerpos de la invención también se pueden administrar por vía tópica. Mediante "administración tópica" se quiere decir la administración no sistémica e incluye la aplicación de un compuesto de anticuerpo (o fragmento del mismo) de la invención externamente a la epidermis, la cavidad bucal y la instilación de dicho anticuerpo en el oído, ojos y nariz, y en la cual éste no entra en forma significativa al torrente sanguíneo. Mediante administración sistémica se quiere decir la administración oral, intravenosa, intraperitoneal e intramuscular. Desde luego, la cantidad de un anticuerpo requerida para un efecto terapéutico o profiláctico variará con el anticuerpo elegido, la naturaleza y gravedad de la condición que está siendo tratada y del animal sometido a tratamiento, y por último queda a discreción del médico. Una dosis tópica apropiada de un anticuerpo de la invención por lo general estará dentro del intervalo de 1 a 100 mg aproximadamente por kilogramo de peso corporal por día.

C. Ligandos solubles para CD40L Además de los anticuerpos que reconocen y se unen a CD40L e inhiben su interacción con CD40, se contemplan otros antagonistas para CD40L para ser utilizados en el tratamiento de linfomas y leucemias de célula B, ya sea solos o en combinación con otras terapias (por ejemplo, radiación o quimioterapia) . Otros antagonistas de CD40L son las formas solubles de un ligando para CD40L. Un ligando para CD40L soluble, monovalente, tal como CD40 soluble, se puede unir a CD40L con lo cual inhibe la interacción de CD40L con el CD40 expresado en célula B. El término "soluble" indica que el ligando no está asociado en forma permanente con una membrana celular. Eso puede preparar un ligando soluble para CD40L mediante síntesis química, o, de preferencia mediante técnicas de ADN recombinante, por »i...-»J,.ji.¿a.^t^-*-.£^p*-^t.>[ -& -. Í .1 1 ejemplo expresando únicamente el dominio extracelular (los dominios de transmembrana y citoplasmático están ausentes) del ligando. Un ligando soluble para CD40L preferido es CD40 soluble. De manera alternativa, un ligando soluble para CD40L puede estar en forma de una proteína de fusión. Dicha proteína de fusión comprende por lo menos una porción del ligando para CD40L unido a una segunda molécula. Por ejemplo, se puede expresar CD40 como una proteína de fusión con una inmunoglobulina (por ejemplo una proteína de fusión CD40-Ig) . En una modalidad, se produce una proteína de fusión que comprende los residuos de aminoácido de una porción del dominio extracelular de la molécula de CD40 unida a los residuos de aminoácido de una secuencia que corresponde a las regiones de gozne C2 y C3 , de una cadena pesada de inmunoglobulina, por ejemplo, Cal, para formar una proteína de fusión CD40-Ig (véase por ejemplo, Linsley et al., J. Exp. Med. 1783: 721-730 (1991); Capón et al., Nature 337: 525-531 (1989); y la patente E.U.A. No. 5,116,964 (1992)) . Tales proteínas de fusión se pueden producir mediante síntesis química, o, de preferencia mediante técnicas de ADN recombinante tomando como base el ADNc de CD40 (Stamenkovic et al., EMBO J. 8:1403-10 (1989)). ^*É Éa-Í-^-iÜy_ÉÉÉ D. Administración de anti-CD40L Se administra un antagonista para CD40L a individuos en una forma biológicamente compatible apropiada para la administración farmacéutica in vivo. Con la frase "forma biológicamente compatible apropiada para administración in vivo" se quiere decir una forma del antagonista que será administrado en la cual cualquiera de los efectos tóxicos es superado por los efectos terapéuticos de la proteína. El término "individuo" tal como se utiliza en la especificación pretende incluir organismos vivos en los cuales se puede provocar una respuesta inmune, por ejemplo, mamíferos. Los ejemplos de individuos preferidos incluyen humanos, perros, gatos, caballos, ungulados, vacas, cerdos, cabras, ovejas, ratones, ratas, y las especies transgénicas de los mismos. Se puede administrar un antagonista de CD40L en cualquier forma farmacológica, opcionalmente en un vehículo farmacéuticamente aceptable. La administración de una cantidad terapéuticamente efectiva del antagonista se define como una cantidad efectiva, en las dosis y durante los periodos necesarios para conseguir el resultado deseado (por ejemplo, la inhibición del progreso o proliferación del linfoma que está siendo tratado) . Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente activa de un antagonista de CD40L puede variar de conformidad con factores tales como la etapa de la enfermedad (por ejemplo, etapa I contra etapa IV) , la edad, sexo, complicaciones médicas (por ejemplo, linfomas relacionados o que surgen debido al SIDA u otras condiciones o enfermedades inmunosuprimidas) y el peso del individuo, y la capacidad de los antagonistas para provocar una respuesta deseada en el individuo. El régimen de dosificación se puede ajustar para que provea la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, se pueden administrar diariamente varias dosis divididas, o la dosis se puede reducir en forma proporcional según indiquen las exigencias de la situación terapéutica. El compuesto activo, tal como un anticuerpo anti-CD40L, sólo o en combinación con otros agentes activos, se puede administrar en una forma conveniente tal como por ejemplo mediante inyección (subcutánea, por vía intramuscular, intravenosa, etc.), administración oral, inhalación, aplicación transdérmica o administración rectal. Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo se puede recurrir con un material para proteger al compuesto de la acción de enzimas, ácidos y otras condiciones naturales que podrían inactivar al compuesto. Una vía de administración preferida es mediante inyección intravenosa ¿M ?Ob***.. . - ,-,. í-^áJ?.l.*^^*^*^^.**, ¿ iito?í?tá? i?,-***---—- *«•>•'- -*f»4«~~ »A.Ate..*f . &*& i * (?.v.) . Para administrar un antagonista de CD40L mediante administración diferente a la parenteral, podría ser necesario recurrir el antagonista con, o co-administrar el antagonista con, un material para evitar su desactivación. Por ejemplo, se puede administrar un antagonista aún he individuo en un vehículo o diluyente apropiado, coadministrar con inhibidores de enzima o en un vehículo o vector apropiado, tal como un liposoma. Los diluyentes farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina y soluciones reguladoras de pH acuosas. Los inhibidores de enzima incluyen al inhibidor de tripsina pancreática, di- isopropilfluorofosfato (DEP) y trasilol. Los liposomas incluyen emulsiones agua en aceite en agua, así como los liposomas convencionales (Strejan et al., J. Neuroimmunol . 7:27-41 (1984)) . Los excipientes y vehículos farmacéuticamente aceptables adicionales son conocidos en la técnica. El compuesto activo también se puede administrar por vía parenteral o por vía intraperitoneal. También se pueden preparar dispersiones en glicerol, polietilenglicoles líquidos, y mezclas de los mismos y en aceites. Bajo las condiciones normales de almacenamiento y uso, estos preparados pueden contener un conservador para evitar el crecimiento de microorganismos. Las composiciones farmacéuticas apropiadas para uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (en los casos en que sea soluble en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la composición debe ser estéril y debe ser fluida hasta el grado en el cual se presente una administración fácil mediante jeringa. Esta debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento y se debe conservar contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, y polietilenglicol líquido y similares) , y mezclas apropiadas de los mismos. La fluidez apropiada se puede mantener, por ejemplo, utilizando un recubrimiento tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de agentes tensioactivos. La prevención de la acción de los microorganismos se puede obtener utilizando diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible incluir en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio. La absorción prolongada de las composiciones inyectables se puede obtener incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina. Se pueden preparar soluciones inyectables estériles incorporando un compuesto activo (por ejemplo un antagonista de CD40L sólo o en combinación con otros agentes activos) en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o con una combinación de ingredientes listados a la presente invención, según se requiera, seguido por esterilización por filtración. En general, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril, que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos provenientes de aquellos antes enumerados. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y secado por congelamiento, lo cual produce un polvo de un ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución del mismo previamente esterilizada por filtración. Cuando el compuesto activo está protegido en forma apropiada, como se describió anteriormente, la proteína se puede administrar por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. Tal como se utiliza en la presente invención, "vehículo farmacéuticamente aceptables" incluye cualquiera y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes para retraso de absorción e isotónicos, y similares. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacológicamente activas es bien conocido en la técnica. Excepto en cuanto a que cualquiera de los medios o agentes convencionales sea incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones terapéuticas. Todas las composiciones discutidas anteriormente para ser utilizadas con antagonistas de CD40L también pueden comprender compuestos activos complementarios (por ejemplo, agentes quimioterapéuticos en anticuerpos anti-CD20) en la composición.

E . Administración de anti-CD40L con otros agentes Enfermedad de Hodgkin Cada año se diagnostican aproximadamente 7,500 casos nuevos de la enfermedad de Hodgkin (HD) en los Estados Unidos de Norteamérica. La terapia con radiación sola se ha utilizado para tratar la etapa I, II e incluso la etapa III de HD. La radiación también se ha utilizado en combinación con quimioterapia (por ejemplo, ABVD y MOPP) . Véase V.T. DeVita et al., "Hodgkin' s Disease", en CÁNCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, vol. 2, 2142-2283 (DeVita et al., eds., 5a edición 1997) y las referencias citadas en el mismo para la administración de protocolos de radiación y quimioterapia para el tratamiento de HD. Los fármacos para " quimioterapia útiles para tratar HD incluyen agentes alquilantes, alcaloides de vinca (por ejemplo, vincristina y vinblastina) , procarbazina, metotrexato y prednisona. La combinación de cuatro fármacos MOPP (mecletamina (mostaza nitrogenada) , vincristina (Oncovin) , procarbazina y prednisona) que es muy efectiva para tratar HD . En pacientes resistentes a MOPP, se pueden utilizar las combinaciones ABVD (por ejemplo, adriamicina, bleomicina, vinblastina y dacarbazina) , ChlVPP (clorambucil , vinblastina, procarbazina y prednisona) , CABS (lomustina, doxorubicina, bleomicina y estreptozotocina) , MOPP más ABVD, - a*-- ^^bÉag^tajt taAaltrfliMMttaaa^&^.^jt^.A* .1...

MOPP más ABV (doxorubicina, bleomicina y vinblastina) o BCVPP (carmustina, ciclofosfamida, vinblastina, procarbazina y prednisona) . Arnold S. Freedman y Lee M. Nadler, Malignant Lymphomas, en HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE 1774-1788 (Kurt J. Isselbacher et al., eds., 13a edición 1994) y V.T. DeVita et al., (1997) y las referencias citadas en los mismos para la programación y dosificación estándar. Estas terapias se pueden utilizar sin cambiar, o se pueden alterar según sea necesario para un paciente particular, en combinación con antagonistas de CD40L solos o en combinación adicional con anticuerpos anti-CD20 fragmentos del mismo. Para HD de recidiva, o resistente, se pueden utilizar regímenes de combinación de rescate de dosis convencional en combinación con anticuerpos anti-CD40L, solos o en conjunto con anticuerpos anti-CD20. Los ejemplos de regímenes para HD de combinación de rescate de dosis convencional incluyen VABCD (vinblastina, doxorubicina, dacarbazina, lomustina y bleomicina) , ABDIC (doxorubicina, bleomicina, dacarbazina, lomustina, prednisona) , CBVD (lomustina, bleomicina, vinblastina y dexametasona) , PCVP (vinblastina, procarbazina, ciclofosfamida y prednisona) , CEP (lomustina, etopósido y prednimustina) , EVA (etopósido, vinblastina y doxorubicina) , MOPLACE (ciclofosfamida, etopósido, prednisona, metotrexato, citarabina y vincristina) , MIME (metilGAG, ifosfamida, metotrexato y etopósido) , MINE (mitoquazona, ifosfamida, vinorelbina y etopósido) , MTX-CHOP (metotrexato y CHOP) , CEM (lomustina, etopósido y metotrexato) , CAVP (lomustina, melfalan, etopósido y prednisona) , EVAP (etopósido, vinblastina, citarabina y cisplatina) , EPOCH (etopósido, vincristina, doxorubicina, ciclofosfamida y prednisona) utilizando las dosis y programación como se describe en V.T. DeVita et al., (1997) .

Linfoma de tipo no Hodgkin (NHL) Cada año se diagnostican aproximadamente 40,000 casos nuevos de NHL en los Estados Unidos Norteamérica, y parece que éste número es cada vez mayor. Además, NHL ocupa el cuarto lugar en el número total de personas-años de vida perdidos anualmente por cáncer. NHL comprende varios subtipos de linfomas, con una presentación clínica y una historia natural únicas. El análisis de los subtipos de NHL queda establecido por una clasificación común para los NHL, la Formulación de Trabajo. El cuadro 1 indica los tres grados de la formulación de trabajo.

CUADRO 1 Los tipos de célula B de NHL incluyen: linfoma linfocítico pequeño/leucemia linfocítica crónica de célula B (SLL/B-CLL) , linfoma linfoplasmacitoide (LPL) , linfoma de célula de manto (MCL) , linfoma folicular (FL) , linfoma de célula grande difusa (DLCL) y linfoma de Burkitt (BL) . Véase Gaidano et al., "Lymphomas" , en C NCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, vol. 2, 2131-2145 (DeVita et al., eds., 5a edición 1997). También se utilizan otras dos formulaciones (por ejemplo la formulación de Kiel y la Clasificación de Linfoma Europea Americana Revisada, o REAL por sus siglas en inglés) en oncología, y los nombres de los NHL pueden variar como entre los dos sistemas de clasificación. Véase M.A. Shipp et al., "Non-Hodgkin' s Lymphomas", en C NCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, vol. 2, 2165-2220 (DeVita et al., eds., 5a edición 1997). Los línfomas de NHL también se pueden clasificar por la edad del paciente en el cual se diagnostica: CUADRO 2 Linfomas de célula B de adulto Linfomas de célula B infantiles Linfoma folicular Linfoma de Burkitt Linfoma de célula B grande Linfoma de célula B grande difusa difusa Linfoma de célula de manto Linfoma folicular B-LBL precursor B-CLL/SLL Inmunocitoma/célulaB monocitoide/tipo MALT de Waldenstrom La radioterapia típicamente se limita a tratar pacientes diagnosticados con NHL de grado bajo en etapa I o II, y como una modalidad curativa potencial para pacientes quienes han sido atacados en forma agresiva. Esta invención contempla combinar un antagonista de CD40L con radioterapia, y también otras modalidades de tratamiento para cáncer para tratar NHL. La quimioterapia se utiliza para la mayoría de pacientes con etapa II y todos pacientes con enfermedad en etapa III y IV. Los regímenes y incluyen el uso de agentes alquilantes individuales tales como ciclofosfamida o clorambucil, o combinaciones tales como CVP (ciclofosfamida, vincristina y prednisona) , CHOP ( (CVP y doxorubicina) , C-MOPP (ciclofosfamida, vincristina, prednisona y procarbazina) , CAP-BOP (CHOP más procarbazina y bleomicina) , m-BACOD (CHOP más metotrexato, bleomicina y leucovorina) , ProMACE-MOPP (prednis na, metotrexato, doxorubicina, ciclofosfamida, etopósido y leucovorina más MOPP estándar) , ProMACE-CytaBOM (prednisona, doxorubicina, ciclofosfamida, etopósido, citarabina, bleomicina, vincristina, metotrexato y leucovorina) y MACOP-B (metotrexato, doxorubicina, ciclofosfamida, vincristina, prednisona de dosis fija, bleomicina y leucovorina). Véase Shipp et al., (1997), para dosis estándar y programación. CHOP también se ha combinado con bleomicina, metotrexato, procarbazina, mostaza nitrogenada, citosina arabinósido y etopósido. Los fármacos menos utilizados en forma común para tratar NHL incluyen: 2-cloro desoxi adenosina (2-CDA) , 2 ' -desoxicoformicina y fludarabina. Para pacientes con NHL de grado intermedio y alto, quienes no pueden obtener la remisión o relapso se utiliza la terapia de rescate. Las terapias de rescate emplean fármacos tales como arabinósido de citosina, cisplatina, etopósido e ifosfamida administrado solos o en combinación. Arnold S. Freedman y Lee M. Nadler, Malignant Ly phomas, en HARRISON'S PRINCIPLES OF INTERNAL MEDICINE 1774-1788. En el caso de las formas agresivas, de recidiva de NHL, se recomiendan los siguientes protocolos IMVP-16 (ifosfamida, metotrexato y etopósido) , MIME (metil-GAG, ifosfamida, metotrexato y etopósido) , DHAP (dexametasona, citarabina a dosis elevadas y cisplatina) , ESHAP (etopósido, metil prednisolona, citarabina HD, cisplatina), CEPP(B) (ciclofosfamida, etopósido, procarbazina, prednisona y bleomicina) y CAMP (lomustina, mitoxantrona, citarabina y prednisona) utilizando las dosis y programas descritos en Shipp et al. , (1997) . Los protocolos recomendados por la histología y etapa para NHL pediátrico son los siguientes: CUADRO 3 APO = doxorubicina, prednisona y vincristina; COMP = ciclofosfamida, oncovin, metotrexato y prednisona. Véase H.J. Weinstein et al., "Leukemias and Lymphomas of Childhood", en C NCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, vol. 2, 2145-2165 (DeVita et al., eds., 5a edición 1997) y las referencias citadas en el mismo, de las cuales todas se incorporan en la presente invención para referencia. Se pueden utilizar los anticuerpos anti-CD40L y antagonistas para CD40L en combinación con cualquiera de los agentes quimioterapéuticos y/o radioterapia actualmente en uso para el tratamiento de HD o el subtipo de NHL *?n*JÍ? ll ~ , .?i, .^^tAJi^^*^*i*^j|^¡at¡ttlf? g]g|gj^ *MttiMÍÍ ¡t' —«"••"»• diagnosticado. También se pueden agregar anticuerpos anti-CD20 al cóctel de agentes terapéuticos utilizado. La cantidad de agente quimioterapéutico que será utilizada en combinación con los anticuerpos anti-CD40L o los antagonistas de CD40L puede variar por el sujeto o se puede administrar de conformidad con lo que se sabe en la técnica. Véase por ejemplo, Bruce A Chamber et al., Antineoplastic Agents, en GOODMAN & GILMAN'S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS 1233-1287 ((Joel G. Hardman et al., eds., 9a edición, 1996) .

Leucemias y otros tumores malignos Las terapias y métodos de tratamiento contemplados de la presente invención también se pueden utilizar para tratar leucemias de célula B, incluyendo ALL-L3 (leucemia tipo Burkitt) y leucemia linfocítica crónica (CLL por sus siglas en inglés) , así como leucemias de célula monocítica y otros tumores malignos que expresen CD40. El tratamiento para ALL incluye el uso de vincristina y prednisona. A estos tratamientos también se han agregado antraciclina, ciclofosfamida, L-asparaginasa.

Otras terapias de inducción incluyen combinaciones de cuatro fármacos (vincristina, prednisona, antraciclina y ., -**??At??^a??ue^? .a.¡^li^-... . ..^??Sj¿^.tl^ *&aá^ ciclofosfamida o asparaginasa) o de cinco fármacos (vincristina, prednisona, antraciclina, ciclofosfamida y asparaginasa) . Para terapias y dosificaciones adicionales, véase D.A. Scheinberg et al., "Acute Leukemias", en C NCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, vol. 2, 2193-2321 (DeVita et al., eds., 5a edición 1997). El tratamiento para CLL incluye las combinaciones quimioterapéuticos de CMP, CVP, CHOP, COP, y CAP (ciclofosfamida, doxorubicina y prednisona) . El tratamiento en pacientes con CLL refractaria incluye el uso de análogos de purina (por ejemplo, monofosfato de fludarabina, 2-clorodesoxiadenosina y pentostatina) . Véase A.B. Deisseroth et al., "Chronic Leukemias", en C NCER: PRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY, vol. 2, 2193-2321 (DeVita et al., eds., 5a edición 1997).

Anticuerpos anti-CD20 y anti-CD40 Esta invención contempla también combinar anticuerpos anti-CD40L, tales como IDEC-131, con anticuerpos anti-CD20 poco fragmentos terapéuticamente efectivos del mismo y/o anticuerpos anti-CD40 o fragmentos terapéuticamente efectivos del mismo. Los anticuerpos anti-CD20 preferidos son RITUXAN® y Bl (véase patente E.U.A. No. 5, 843, 398) . Para la descripción, preparación y utilización de anti-CD40L (también conocido como anti-gp39) , véase las solicitudes de patente E.U.A. cedidas en forma mancomunada, No. de serie 08/554, 840, presentada el 7 de noviembre de 1995, 08/925, 339, presentada el 8 de septiembre de 1997, 09/069, 871, presentada el 30 de abril de 1998 y 09/332, 595, presentada a 14 de junio de 1999, y la patente E.U.A. No. 5, 747, 037. Los anticuerpos anti-CD40 preferidos, y su preparación se describen en las patentes E.U.A. Nos. 5, 8074, 085; 5, 874, 082; 5, 801, 2 00 27; 5 ,667 ,165; 5 ,674, 492 y 5, 667, 165 de las cuales todas se incorporan en la presente invención para referencia en su totalidad. Toda la discusión referente a los anticuerpos anti-CD20 tal como se describe en la presente invención, se aplican de igual manera a los anticuerpos anti-CD40. Debido a que los trastornos de célula B de sangre periférica, por definición, pueden indicar una necesidad de tener acceso a la sangre para tratamiento, la vía de administración de los anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos y de los anticuerpos anti-CD20 radio marcados de preferencia es la vía parenteral; tal como se utiliza en la presente invención, el término "parenteral" incluye la administración intravenosa, intramuscular, Jf*rt J #rHfttr* ~" - T^G-' — "t subcutánea, rectal, vaginal o intraperitoneal. De éstas, la administración intravenosa es la más preferida. Los anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos y los anticuerpos anti-CD20 radio marcados serán suministrados típicamente utilizando técnicas estándar dentro de una solución reguladora de pH farmacéuticamente aceptable, por ejemplo, solución salina estéril, agua regulada estéril, propilenglicol, combinaciones de los anteriores, etcétera. Los métodos para preparar agentes que se puedan administrar por vía parenteral se describen en PHARMACEUTICAL CARRIERS & FORMULATIONS, Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences, 15a edición (Mack. Pub. Co . , Easton, Pa . , 1975), el cual se incorpora en la presente invención para referencia, o como se describió anteriormente. La cantidad terapéuticamente efectiva, específica de anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos útil para producir un efecto terapéutico único en cualquier paciente dado se puede determinar utilizando técnicas estándar bien conocidas por los expertos en la técnica. Las dosis efectivas (es decir cantidades terapéuticamente efectiva se) de los anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos varían entre 0.001 »Í?i.??M.**l??.? -í -J tS?. -»».a-. aproximadamente hasta 30 mg/kg de peso corporal aproximadamente, de preferencia entre 0.01 y 25 mg/kg de peso corporal aproximadamente, más preferido entre 0.4 aproximadamente y 20.0 mg/kg de peso corporal aproximadamente. También son viables otras dosis. Los factores que influyen en la dosis incluyen, pero no se limitan a, la gravedad de la enfermedad; los métodos de tratamiento anteriores; la salud general del paciente; la edad del paciente; otras enfermedades presentes, etcétera. El experto en la técnica fácilmente puede evaluar a un paciente particular y determinar una dosis apropiada que caiga dentro de los intervalos, o si fuera necesario, fuera de los intervalos según se necesite. La introducción de los anticuerpos anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activos u otros anticuerpos para CD20 (por ejemplo RITUXAN® o Bl) en estos intervalos de dosis se puede efectuar como un tratamiento individual o a través de una serie de tratamientos. Con respecto a los anticuerpos quiméricos, se prefiere que tal administración se efectúe a través de una serie de tratamientos. Este método preferido se basa en la metodología de tratamiento asociada con esta enfermedad. En efecto, aunque una sola dosis provee beneficios y se puede utilizar en forma efectiva para el tratamiento/manejo de la en erme a , se puede presentar un curso de tratamiento preferido a través de varias etapas; tal manera más preferida, se introducen entre aproximadamente 0.4 y aproximadamente 20 mg/kg de peso corporal del anticuerpo 5 anti-CD20 quiméricos inmunológicamente activo por otro anticuerpo anti-CD20 al paciente una vez por semana entre aproximadamente 2 y 10 semanas, más preferido durante aproximadamente 4 semanas. Con referencia al uso de anticuerpos anti-CD20 y/o 0 anticuerpos anti-CD40 radiomarcados, se prefiere que el anticuerpo sea (1) no quimérico o (2) que serán anticuerpos humanizados quiméricos con dominios suprimidos o (3) que sean anticuerpos de humano. Esta preferencia se basa en la vida media en circulación significativamente más corta de 5 los anticuerpos con dominios suprimidos o de múrido en comparación con los anticuerpos quiméricos humanizados completos (es decir, con una vida media en circulación más larga, el radionúclido está presente en el paciente durante periodos prolongados) . Sin embargo, los anticuerpos 0 quiméricos radiomarcados se pueden utilizar en forma benéfica con dosis menores de mili-curios ("mCi") utilizados en conjunto con el anticuerpo quimérico sin marcar con relación al anticuerpo. Este escenario permite una reducción i^^^waa^ttfc^^aifaW en la toxicidad de la médula ósea hasta un nivel aceptable, mientras que al mismo tiempo mantiene la utilidad terapéutica. Las formas quiméricas radiomarcadas de anti-CD20 se pueden preparar como se describe en las patentes E.U.A. Nos. 5 ,776 ,456 y 5, 843 ,439. Las dosis de tratamiento individual efectivas (es decir, cantidades terapéuticamente efectivas) de anticuerpos anti-CD20 marcados con itrio-90 varían desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 120 mCi, más preferido entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40 mCi para anticuerpos de múrido y entre aproximadamente 30 y aproximadamente 100 mCi para anticuerpos con dominios suprimidos. Las dosis no ablativas para médula de tratamiento individual efectivas de anticuerpos anti-CD20 marcados con yodo-131 varían entre aproximadamente 5 y aproximadamente 70 mCi, de preferencia entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40 mCi . Las dosis ablativas de tratamiento individual efectivas (es decir que podrían requerir transplante autólogo de médula ósea) de anticuerpos anti-CD20 marcados con yodo- 131 varían entre aproximadamente 30 y aproximadamente 600 mCi, de preferencia entre aproximadamente 50 y menos de aproximadamente 500 mCi . En conjunto con un anticuerpo anti-CD20 quimérico, debido a la vida media en circulación más prolongada en comparación lM?Ñk*A.¡*.tM>*-j¿ ?SLAJ!i¡Aíi | f -jJMilfMii con los anticuerpos de múrido, una dosis no ablativa de médula de tratamiento individual efectivo de anticuerpos anti-CD20 quiméricos marcados con yodo-131 varían entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40 mCi , se preferencia menos de aproximadamente 30 mCi . Los criterios para formación de imagen para, por ejemplo el marcador indio- 111 típicamente son menores de aproximadamente 5 mCi . Una discusión adicional sobre la preparación y uso de anticuerpos anti-CD20 radiomarcados se puede encontrar en las patentes E.U.A. Nos. 5,843,398 y 5,843,439, de las cuales ambas se incorporan en la presente invención para referencia en su totalidad.

Anticuerpos radiomarcados con referencia al uso de anticuerpos radiomarcados (por ejemplo, específicos para CD40, CD40L y/o CD20), se prefiere que el anticuerpo sea no quimérico; esta preferencia se basa en la vida media en circulación significativamente más larga de los anticuerpos quiméricos contra los anticuerpos de múrido (es decir, con una vida media en circulación más larga, el radionúclido está presente en el paciente por periodos extendidos) . Sin embargo, los anticuerpos quiméricos radiomarcados se pueden Lá. «IM.«.. j***fa*fcAia«tt_? utilizar en forma benéfica con dosis en milicupos ("mCi") más bajas utilizadas en conjunto con el anticuerpo quimérico con relación al anticuerpo de múrido. Este escenario permite una reducción en la toxicidad a la médula ósea hasta un nivel aceptable, y al mismo tiempo mantiene la utilidad terapéutica . Se puede aplicar una variedad de radionúclidos a la presente invención y los expertos en la técnica poseen la capacidad para determinar fácilmente cuál radionúclido es el más apropiado bajo una variedad de circunstancias. Por ejemplo, el yodo- 131 (131I) es un radionúclido bastante conocido que se utiliza para inmunoterapia dirigida. Sin embargo, la utilidad clínica de 131I puede quedar limitada por varios factores incluyendo: vida media física de ocho días; deshalogenación del anticuerpo yodado tanto en sangre como en los sitios de tumor; y características de emisión (por ejemplo un componente gamma grande) los cuales pueden ser sub óptimas para la deposición de dosis localizada en el tumor. Con el advenimiento de agentes quelantes superiores, la oportunidad para unir grupos quelantes de metal a las proteínas ha incrementado las oportunidades para utilizar otros radionúclidos tales como indio-131 (131In) e ytrio-90 (90Y) . 90Y provee varios beneficios para la utilización en aplicaciones de radioinmunoterapia : la vida media de 64 horas de 90Y es lo suficientemente larga para permitir la acumulación de anticuerpos por parte del tumor y, a diferencia de, por ejemplo, 1311 , 90Y es un emisor beta puro de alta energía sin que se presente radiación gamma acompañante en su degradación, con un intervalo en tejidos de 100 a 1000 diámetros celulares. Además, la cantidad mínima de radiación penetrante permite la administración de anticuerpos marcados con 9°Y en pacientes externos. En forma adicional, no se requiere la internalización de anticuerpo marcado para aniquilamiento de células, y la emisión local de radiación ionizante debe ser letal para las células de tumor adyacentes que carecen del antígeno objetivo. Una limitación no terapéutica para 90Y se basa en la ausencia de radiación gamma significativa que hace que la formación de imágenes con el mismo sea difícil. Para evitar este problema, se puede utilizar un radionúclido para "formar imágenes" para diagnóstico, tal como ind?c-111 (?:L1In) para determinar la ubicación y tamaño relativo de un tumor antes de la administración de dosis terapéuticas de anti-CD20 marcado con 90Y. El indio-111 es particularmente preferido como el radionúclido para diagnóstico debido a que se pueden administrar en forma segura entre aproximadamente U, W"\ m ~~~ uno y aproximadamente 10 mCi, sin una toxicidad que pueda ser detectada; y los datos para formación de imágenes por lo general pronostican la distribución de anticuerpo marcado con 90Y subsiguiente. La mayoría de los estudios de 5 formación de imágenes utilizan anticuerpo marcado con 5 mCi de l?:LIn, debido a que esta dosis es segura y tiene una eficiencia de formación de imagen incrementada en comparación con dosis menores, con lo cual la formación de imagen óptima se presenta entre los tres y los seis días 10 después de la administración del anticuerpo. Véase, por ejemplo, Murray, J. Nuc . Med. , 26:3328 (1985) y Carraguillo et al., J. Nuc . Med. , 26:67 (1985). Las dosis de tratamiento individual efectivas (es decir cantidades terapéuticamente efectivas) de anticuerpos 15 marcados con 90Y (por ejemplo anticuerpos anti-CD40L, anti- CD20 y anti-CD40) varían entre aproximadamente 5 y aproximadamente 75 mCi, T. preferencia entre aproximadamente 10 y aproximadamente 40 mCi . Las dosis de tratamiento individual efectivas no ablativas para médula de anticuerpos 20 marcados con 131I varían entre aproximadamente 5 y aproximadamente 70 mCi, de preferencia entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40 mCi . Las dosis de tratamiento individual efectivas ablativas (es decir que podrían z -i ^-Ji^.^ ^*^^.* **.^ jfcf,. j f-.. requerir transplante autólogo de médula ósea) de anticuerpos marcados con 131I varían entre aproximadamente 30 y aproximadamente 600 mCi , de preferencia entre aproximadamente 50 y menos de aproximadamente 500 mCi . En conjunto con un anticuerpo quimérico, debido a la vida media en circulación más prolongada en comparación con los anticuerpos de múrido, una dosis de tratamiento individual efectiva, no ablativa de médula, de anticuerpos quiméricos marcados con yodo- 131 (131I) varían entre aproximadamente 5 y aproximadamente 40 mCi , de preferencia menos de aproximadamente 30 mCi . Los criterios para formación de imagen para, por ejemplo el marcador indio-111, típicamente son menores de aproximadamente 5 mCi . Con respecto a los anticuerpos radiomarcados para terapia, las dosis se pueden presentar utilizando un tratamiento de terapia individual o utilizando tratamientos múltiples. Debido al componente de radionúclido, se prefiere que antes del tratamiento, se "cosechen" células madre periféricas ("PSC" por sus siglas en inglés) o médula ósea ("BM") para pacientes que experimentan toxicidad de médula ósea potencialmente fatal proveniente de la radiación. BM y/o PSC se cosechan utilizando técnicas estándar, y después se purgan y congelan para una posible reinfusión. De manera . ? ^**-.-*^*,,.-.. *»*** .*. i.^áu?UJMi^Ltíl adicional, es más preferido que antes del tratamiento se efectúe un estudio de dosimetría de diagnóstico utilizando un anticuerpo marcado para diagnóstico (por ejemplo, utilizando xliIn) en el paciente, cuyo propósito es asegurar que el anticuerpo marcado terapéuticamente (por ejemplo, utilizando 90Y) no se "concentrará" en forma innecesaria en ningún órgano o tejido normal. Los radioisótopos adicionales que se pueden util i zar incluyen 1123JI- , 112Z53-I, , 113J11-In, 3 U2, , bqC , 6 °7'C, u, 2 ¿111~At , 1 A1"' Lu, 90Y, 185Re , 212Pb, 21 Bi , 47Sc, 105Rh, 109Pd, 153Sm, 188Re , 199Au, 211At , y 213Bi . La cantidad de radiación suministrada dependerá, en parte, de la vida media y del tipo de emisión de partícula . Se utilizaron los siguientes materiales y métodos en los experimentos descritos más adelante. Los ejemplos provistos más adelante no limitan la invención como se describe o reclama, sino solamente suministran modalidades de la invención reclamada. y *.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Propiedades de las células de linfoma B, células DHL-4 Se evaluó el concepto que el anticuerpo anti-CD40L puede bloquear la supervivencia, mediada por CD40L-CD40, de células B malignas a partir de la toxicidad/apoptosis inducida por quimioterapia in vitro utilizando IDEC-131, y la línea celular de linfoma B, DHL-4 (Roos et al., Leuk . Res . 10: 195-202 (1986) expuesta a adriamicina (ADM). IDEC-131 es una porción humanizada de un anticuerpo anti-CD40L de humano monoclonal, de múrido, 24-31. Inicialmente, se determina la concentración de ADM citotóxica para las células DHL-4 exponiendo las células DHL-4 durante 4 horas a concentraciones diferentes de ADM. Se mide la citotoxicidad de las células DHL-4 después de cinco días en cultivo mediante Azul Alamar, una prueba de reducción de colorante utilizando células vivas (véase Gazzano-Santoro et al., J". I unol . Meth . 202: 163-171 (1997)). En breve, se incuban 1 x 105 células DHL-4 en medio de crecimiento (RMPI-1640 + 10% de suero fetal bovino) con concentraciones variables de ADM (1 x 10~6 M a 1 x 10~8 M) en ¡f?J?**?né-*t.Ml Í?ll L...*¿l*r?T&t?,'-ií.?&*,-*2f [M tubos para cultivo celular a 37°C, durante 4 horas. Después de la incubación, las células se lavan, se vuelven a suspender en medio de crecimiento a una concentración de 1 x 105 células/ml y se agregan 200 µl de suspensión celular a cada una de las cavidades de una placa de 96 cavidades de fondo plano. Las placas se incuban a 37°C, y se evalúan respecto a la citotoxicidad en diferentes puntos de tiempo. Durante las últimas 18 horas de incubación, se agregan a cada cavidad 50 µl del colorante redox Azul Alamar (Biosource International, # de Cat. DAL 1100). Después de la incubación, las placas se enfrían incubando a temperatura ambiente durante 10 minutos en un agitador, y se determina la reducción intracelular del colorante. Se lee la fluorescencia utilizando un fluorómetro de 96 cavidades con excitación a 530 nm y emisión a 590 nm. Los resultados se expresan como unidades de fluorescencia relativas (RFU por sus siglas en inglés) . El porcentaje de citotoxicidad se calcula como sigue: [1- (RFU promedio de la muestra de prueba + RFU promedio de las células de control)] x 100% Se establece la curva de citotoxicidad de ADM y se seleccionan concentraciones mínimas del fármaco para [t i ¡ríijlj-"- -~- -*.íAn,..itsí .-^s¡* SSÉ?¡at^3M. citotoxicidad para las pruebas posteriores. Los resultados, como se muestran en la figura 1, muestran citotoxicidad celular de las células DHL-4 cultivadas durante 5 días después de exponerlas a ADM (2 x 10"7 M y 4 x 10"8 M de ADM) durante 4 horas antes del cultivo. Las células se lavan una vez después de la exposición y se cultivan en medio de crecimiento durante 5 días y se determina la citotoxicidad mediante la prueba de absorción de colorante azul de Alamar, como se describió anteriormente. De manera adicional, las células DHL-4 se caracterizan por la expresión en membrana de moléculas CD seleccionadas mediante citometría de flujo. Se encontró en las células DHL-4 expresan moléculas de CD19, CD20, CD40, pero no se detecta la expresión de CD40L.

EJEMPLO 2 El anticuerpo anti-CD40L anula la resistencia mediada por CD40L al aniquilamiento por adriamicina de las células de linfoma B La figura 2A muestra el efecto de un anticuerpo anti-CD40L (IDEC-131) sobre la resistencia mediada por CD40L-CD40 candela células DHL-4 a la muerte celular -:S-.. :ÍÍÁÍ? ---I -,£¿, -,- ¡'irtfi tíié?l inducida por ADM. Se incuban células DHL-4 (0.5 x 106 células/ml) en presencia de 10 µg/ml de CD40L soluble (sCD40L, P.A. Brams, E. A. Padlan, K Hariharan, K. Slater, J. Leonard, R. Noetle y R. Newman, "A humanized anti-human CD154 monoclonal antibody blocks CD154-CD40 mediated human B cell activation" , (manuscrito enviado) ) durante una hora a 37°C. Después de una hora de incubación, se agregan concentraciones bajas de ADM (2 x 10"7 M - 4 x 10"8 M) y se incuban durante otras 4 horas en presencia o en ausencia de CD40L (10 µg/ml) . Después de la exposición a ADM, las células se lavan y se vuelven a suspender en medio de crecimiento a una concentración de 0.5 x 106 células/ml, y se agregan 100 µl de la suspensión celular a cada cavidad de una placa de fondo plano de 96 cavidades, por duplicado, con o sin sCD40L. Se agrega SCD40L (10 µg/ml) a los cultivos que se han expuesto en forma continua a sCD40L durante el tratamiento con ADM y a cultivos sin sCD40L durante la exposición a ADM. Además, se agrega IDEC-131 a una concentración de 10 µg/ml a los cultivos para determinar su efecto sobre las células DHL-4 incubadas con SCD40L y ADM. Después de 5 días, se mide la citotoxicidad mediante la prueba de porción del colorante azul de Alamar, como se describió. Los datos demuestran que SCD40L prolonga la supervivencia de las células DHL-4 después de tratamiento con ADM, mientras que, como se espera, se observa citotoxicidad incrementada en las células que fueron expuestas a ADM en ausencia de sCD40L. Además, la adición de anticuerpo anti-CD40L (IDEC-131) invierte la supervivencia células mediada por CD40L, lo que lleva a un incremento en la citotoxicidad celular (figura 2A) . La adición de IDEC-131 sólo no tiene efecto sobre las células DHL-4 tratadas con SCD40L, loco indica que el anticuerpo, por sí mismo, no tiene ninguna de las actividades inhibidoras o citotóxicas directas sobre las células DHL-4 (figura 2B) . Las células DHL-4 pre-incubadas con y sin sCD40L se cultivan en presencia de concentraciones diferentes de IDEC-131, RITUXAN®, el anticuerpo anti-CD20 CE9.1, y anticuerpos anti-CD4 (Anderson et al., Clin. Immunol . & Immunopathol . 84: 73-84 (1997)). Después de 5 días, se determina la citotoxicidad/proliferación de células DHL-4 utilizando la prueba con azul Alamar, como se describió anteriormente. La figura 2B no muestra efecto sobre la proliferación o la citotoxicidad de las células DHL-4 por IDEC-131, mientras que RITUXAN®, como se esperaba, ^yh-..^Stea¿-fc„.....«¿fr¿ ^At.?.. «^^^A^J^üi^... ,-si?tiUh., inhibe la proliferación celular y la citotoxicidad inducida. Los observa efecto en las células DHL-4 cultivadas con anticuerpos anti-CD4.

EJEMPLO 3 La señalización de CD40L-CD40 previene la apoptosis de células de linfoma B mediante el anticuerpo anti-CD20, RITUXAN® Se determina el efecto de la señalización mediada por CD40L-CD40 sobre la apoptosis inducida por anticuerpo anti-CD20 de células de linfoma B utilizando un sistema invitó que implica células DHL-4 y el entrelazamiento en superficie de RITUXAN®. Se cultivan células DHL-4 (0.5 a 1 x 106 células/ml) con sCD40L (10 µg/ml) a 37°C después de cultivar durante toda la noche, las células se cosechan y se incuban con 10 µg/ml de RITUXAN® o el anticuerpo de control (CE9.1; un anticuerpo anti-CD4) con o sin sCD40L (10 µg/ml) en hielo. Después de incubar durante una hora, las células se centrifugan para remover los anticuerpos no unidos, y se vuelven a suspender a una concentración de 1 x 106 células/ml en medio de crecimiento (5% de FCS-RPMI) y se cultivan en tubos para cultivo de tejidos. Los anticuerpos mt-l tli'^^A *• aaafcR *.*tA3Sdi unidos a la superficie de las células se entrecruzan introduciendo fragmentos F(ab') de anticuerpos de cabra específicos anti-ig-Fc? de humano a una concentración de 15 µg/ml, y los cultivos se incuban a 37°C hasta que se evalúen respecto a la apoptosis. La apoptosis se detecta utilizando una prueba de citometría de flujo con caspasa-3. Las células cultivadas se cosechan a las 4 y 24 horas, se lavan y se fijan a 4°C utilizando Cytofix (estuche Cytofix/Cytoperm™, Pharmingen, # de Cat. 2075KK) . Después del 20 minutos de fijación, las células se lavan y se agregan 15 µl de anticuerpo policlonal anti-caspasa-3 de conejo, conjugado con PE, purificado por afinidad (Pharmingen, # de Cat. 67345) y se agregan 50 µl de cytoperm (Pharmingen, # de Cat. 2075KK) . Las células se incuban en la oscuridad en hielo durante 30 minutos. Después de incubar, las células se lavan una vez y se vuelven a suspender en cytoperm. Los datos de citometría de flujo se obtienen utilizando un aparato FACScan y se analizan utilizando el software WinList de Verity Software House. El cuadro 1 muestra la resistencia de la apoptosis inducida por RITUXAN® en células de linfoma DHL-4 ocasionada por exposición a sCD40L. En estos estudios, se utiliza la activación de caspasa-3 como el marcador sustituto debido a que los estudios anteriores revelaron una correlación adecuada entre caspasa-3 y la prueba Túnel. El entrecruzamiento de RITUXAN® sobre la superficie de las células DHL-4 en presencia de sCD40L reduce los niveles de apoptosis, mientras que las células no expuestas a sCD40L sufrieron apoptosis. En comparación, los cultivos incubados en presencia de un anticuerpo del mismo isotipo, el anticuerpo de control (CE9.1), dio como resultado la ausencia de apoptosis de las células. Por lo tanto, los datos sugieren que la señalización de la ruta de CD40 inducida por SCD40L puede conducir al desarrollo de la aniquilación de células de linfoma B mediada por RITUXAN®.

CUADRO 1 Resistencia de la apoptosis de células DHL-4 mediada por RITUXAN® causada por SCD40L porcentaje de células positivas con actividad de caspasa-3 y su intensidad fluorescente promedio en escala logarítmica EJEMPLO 4 Efecto de IDEC-131 sobre la supervivencia de células de leucemia linfocítica crónica (CLL) Para determinar el efecto de IDEC-131 sobre el crecimiento y supervivencia de células B-CLL ín vitro, se cultivan células B-CLL con y sin IDEC-131 en presencia de CD40L m vitro. Se aislan células mononucleares de sangre periférica (PBMC) a partir de la sangre de pacientes con CLL utilizando centrifugación con gradiente Ficoll-Hypaque. Se determina la viabilidad mediante la prueba de exclusión con colorante azul de Trypan esta es > 98%. El análisis de citometría de flujo revela que más del 70% de los linfocitos son CD19+/CD20+. Se cultivan células CLL (PBMC) en medio de crecimiento para CLL (por ejemplo, medio RPMI-1640 complementado con 5% de FCS o 2% de plasma de donador autólogo, complementado con 2 M de L-glutamina y 100 U/ml de penicilina-estreptomicina) . Además, para algunos experimentos, las células B CD19+ se purificaron utilizando Dynabeads™ para CD19+, de conformidad con las instrucciones del fabricante (Dynal, # de Cat. 111.03/111.04) y se cultivan como se indicó anteriormente. La mayoría de las células CLL o B-CLL purificadas cultivadas en medio de cultivo presentaron muerte celular apoptótica espontánea. Sin embargo, el cultivo de estas células en presencia de sCD40L prolonga su viabilidad en cultivos. El cuadro 2 indica la viabilidad celular de células B-CLL CD19+ cultivadas en presencia o en ausencia de SCD40L (5 µg/ml) en diferentes puntos de tiempo e indica la supervivencia más larga de las células CLL. Las células B-CLL provenientes del paciente #1 cultivadas con sCD40L tienen > 60% de viabilidad por más de dos semanas, mientras que las células cultivadas en ausencia de sCD40L tienen menos del 10% de viabilidad.

Zl.iLa.ii CUADRO II supervivencia de células B-CLL en presencia de sCD40L Muestra B-CLL Tiempo % de viabilidad (a) (Horas) (-)CD40L (+)CD40L 0 >90 >90 48 88 90 Paciente #1 96 46 77 144 30 72 0 90 >90 72 40 72 Paciente #2 96 31 65 144 17 51 exclusión de colorante azul de tripán La figura 3A muestra el efecto de IDEC-131 sobre el crecimiento y supervivencia de células B-CLL después de 7 días en cultivo. Las células B-CLL purificadas provenientes de un paciente con CLL (2 x 106 células/ml) se dividen en dos tubos de cultivo. Las células en uno de los tubos se mezclan con sCD40L (5 µg/ml) en un volumen igual de medio de crecimiento, mientras que el otro tubo se incuba con un volumen igual de medio de crecimiento como control. Después de incubar durante una hora a 37 °C, las células se mezclan suavemente y se agregan 100 µl del medio de suspensión ...asrafca. Art.jj^J. celular a cada cavidad de una placa de 96 cavidades de fondo plano por duplicado, con y sin variación de las concentraciones de IDEC-131 (10 µg/ml hasta 0.3 µg/ml). 7 días después, se determina la supervivencia/muerte celular en cultivo mediante la prueba de azul Alamar, como se describió anteriormente. Los datos demuestran la supervivencia celular en cultivos con SCD40L. La adición de IDEC-131 en cultivo da como resultado un incremento en la muerte celular, lo que indica una inversión de la supervivencia celular o una sensibilización a la muerte celular. De manera adicional, RITUXAN® administrado a la misma concentración que IDEC-131 produce un efecto mucho menor que el de IDEC-131 sobre la muerte celular (figura 3B) .

EJEMPLO 5 regulación positiva de moléculas HLA-DR mediada por CD40L- CD40 en B-CLL para determinar si la ruta de transducción de señal de CD40L-CD40 está intacta o no, se cultivan células de CLL provenientes de pacientes con CLL (5 x 106 células/ml) con y sin 5 µg/ml de CD40L a 37°C. A las 48 horas y a las 144 horas, se determina la molécula de clase II, la expresión de HDA-DR, en células CD19+ mediante citometría de flujo utilizando procedimientos estándar. En breve, se cosechan linfocitos cultivados en puntos de tiempo diferentes y se analizan respecto a la expresión en superficie de moléculas utilizando anticuerpos acoplados ya sea a fluoresceína (FITC) o ficoeritrina (PE) respecto a la tinción sencilla o doble utilizando un citómetro de flujo FACScan (Becton-Dickinson) . Para la tinción para citometría de flujo, se incuban 1 x 106 células en tubos de cultivo con los anticuerpos apropiados como sigue: anticuerpos anti- CD45-FTIC para bloquear la población de linfocitos en una gráfica de dispersión; anti-CD19-PE (Pharmingen, # de cat. 30655) o anti-CD20-FITC (Pharmingen, # de cat. 33264) para determinar las células B CD19+ y/o CD20+; anticuerpos anti- CD3-FITC (Pharmingen, # de cat. 30104) para desbloquear las células T; anti-CD19-RPE y anticuerpos anti-HLA-DR-FITC (Pharmingen, # de cat. 32384) para determinar la expresión de Pclass II en células CD19+. Las células se lavan una vez mediante centrifugación (a 200 x g, durante 6 minutos) con 2 ml de PBS fría y se incuban con anticuerpo durante 30 minutos en hielo, después de lo cual las células se lavan una vez, se fijan en paraformaldehído al 0.5% y se almacenan Jt*?** LjLi*i!&.-¡ a 4°C, hasta que se analizan. Los datos de citometría de flujo se obtienen en un aparato FACScan y se analizan utilizando el software WinList (Verity Software House) . La máquina se ajusta en autobloqueo para permitir el examen de cuadrantes que contienen células con tinción sencilla ya sea con RPE o FITC, sin teñir o con tinción doble. La figura 4 muestra la comparación de la expresión de HLA-DR en células CLL CD19+ con SCD40L y aquellas células no cultivadas con SCD40L. Se detecta un nivel de expresión de HLA-DR más alto en las células B-CLL cultivadas en presencia de sCD40L (Cuadro III) .

CUADRO III regulación positiva de la molécula HLA-DR mediada por CD40L- CD40 en B-CLL células B CD19+ que son positivas para las moléculas HLA-DR y su intensidad fluorescente promedio (MIF) .

EJEMPLO 6 Preparación de IDEC-131 y RITUXAN® Para el tratamiento de tumores malignos CD40~, se infunde a un individuo, por vía intravenosa (iv), IDEC-131 a una concentración entre aproximadamente 10 y aproximadamente 50 mg/ml en una solución reguladora para formulación de 10 mM de citrato de sodio, 150 mM de NaCl, 0.02% de polisirbato 80 a pH 6.5. IDEC-131 se administra antes, después o en conjunto con RITUXAN®. La dosis de RITUXAN® que se infunde varía entre aproximadamente 3 hasta aproximadamente 10 mg/kg de peso del individuo.

EJEMPLO 7 Preparación de IDEC-131 y CHOP Para el tratamiento de tumores malignos CD40+ que responden a CHOP (por ejemplo, enfermedad de Hodgkín, linfomas de tipo no Hodgkin y leucemia lmfocítica crónica, así como terapia de rescate para tumores malignos en los cuales las células son CD40+) , se infunde IDEC-131 a una dosis que varía entre aproximadamente 3 hasta aproximadamente 10 mg por cada kg de peso del paciente inmediatamente antes del inicio del ciclo de CHOP. La administración de IDEC-131 se repite antes de cada ciclo CHOP durante un total de 4 a 8 ciclos.

EJEMPLO 8 Administración de anti-CD40L en combinación con RITUXAN® para tratar linfoma de célula B en un individuo Las terapias de combinación son particularmente útiles como terapias de rescate o para tratar las formas de recidiva o agresivas de tumores malignos CD40+ (por ejemplo, Enfermedad de Hodgkin, linfoma de tipo no Hodgkin y CLL) . Cuando IDEC-131 será administrado en combinación con CHOP y RITUXAN®, IDEC-131 se administra como se discutió anteriormente en el ejemplo 6, seguido por el programa especificada para la administración de CHOP-IDEC-131 en el ejemplo 7. Todas las referencias discutidas anteriormente quedan incorporadas para referencia en su totalidad en la presente invención. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (2)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones: 1.- Un método para tratar tumores malignos CD40 caracterizado porque comprende administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se una a CD40L, con lo cual se inhibe la interacción CD40/CD40L o la señalización para CD40. 2.- El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el tumor maligno CD40^ es un linfoma de célula B o leucemia de célula B. 3.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el linfoma de célula B es la enfermedad de Hodgkin (HD) o linfoma de tipo no Hodgkin (NHL) . 4.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el NHL es de grado bajo, grado intermedio o grado alto. 5.- El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado además porque el NHL se selecciona del grupo de subtipos que consiste de: célula linfocítica -.?lá ¿áíJ¡?¿A< .m¿*¿^*J~ pequeña, folicular y disociada predominantemente pequeña, tipo celular folicular y pequeña disociada y grande mezcladas, tipo celular folicular y predominantemente grande, célula pequeña disociada difusa, célula pequeña y grande difusas mezcladas, célula grande difusa, de tipo de célula grande inmunoblástica, linfoblástica, pequeña no disociada de Burkitt y de tipo no Burkitt, linfomas relacionados con SIDA, linfoadenopatía angioinmunoblástica, linfoma de célula del manto y linfoma de célula B monocitoide. 6.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque la leucemia de célula B es una leucemia de célula B crónica, leucemia linfoblástica aguda de un linaje de célula B, o leucemia lmfocitica crónica de un linaje de célula B. 7.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo que se une a CD40L es IDEC-131, 3E4, 2H5, 2H8, 4D9-8, 4D9-9, 24-31, 24-43, 89-76 O 89-79. 8.- El método de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado además porque el anticuerpo o fragmento de anticuerpo es quimérico, biespecífico, humano o humanizado. 9.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque el fragmento de anticuerpo es Fab, Fab', scFv o F(ab')2. 10.- El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque comprende también administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un segundo anticuerpo o fragmento del mismo, un agente quimioterapéutico, una combinación de agentes quimioterapéuticos y/o una radioterapia. 11.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la radioterapia es tratamiento con radiación externa o con un anticuerpo radiomarcado. 12.- El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado además porque el anticuerpo radiomarcado es IDEC-131, RITUXAN® o Bl o fragmentos de los mismos . 13.- El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el anticuerpo radiomarcado se marca radiactivamente con i23I, í I , 13*I, lxlIn, 131ln, 32P, 64Cu, d7Cu, 211At, 177Lu, 90Y, 18dRe, 212Pb, 2:2B?, 47Sc, :o5Rh, 109Pd, 153Sm, 188Re, 199Au, 211At, y 213Bi . 14.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el agente m lÜHtiri • ttfp>>*^>^*-t** ?* i *- quimioterapéutico para tratar HD es cualquiera de uno o más de los siguientes: un agente alquilante, un alcaloide de vinca, procarbazina, metotrexato o prednisona. 15.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el agente quimioterapéutico para tratar NHL es cualquiera de uno o más de los siguientes: un agente alquilante, ciclofosfamida, clorambucil, 2-CDA, 2' -desoxicoformicina, fludarabina, citosina arabinósido, cisplatina, etopósido o ifosfamida. 16.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la combinación de agentes quimioterapéuticos para .tratar HD es: MOPP, ABVD, ChlVPP, CABS, MOPP más ABVD, MOPP más ABV, BCVPP, VABCD, ABDIC, CBVD, PCVP, CEP, EVA, MOPLACE, MIME, MINE, CEM, MTX-CHOP, EVAP o EPOCH. 17.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la combinación de agentes quimioterapéuticos para tratar NHL es: CVP, CHOP, C-MOPP, CAP-BOP, m-BACOD, ProMACE-MOPP, ProMACE-CytaBOM, MACOP-B, IMVP-16, MIME, DHAP, ESHAP, CEPP(B) o CAMP. 18.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el agente .zfa%^.ii»-t-. F quimioterapéutico para tratar leucemia de célula B es: antraciclina, ciclofosfamída, L-asparaginasa, o un análogo de purina. 19.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque la combinación de agentes quimioterapéuticos para tratar una leucemia de célula B es: vincristma, prednisona, antraciclma y ciclofosfamida o asparaginasa; vmcristma, prednisona, antraciclina, ciclofosfamida y asparagmasa; CHOP; CMP; CVP; COP o CAP. 20.- El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado además porque el segundo anticuerpo es un anticuerpo anti-CD20. 21.- El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el anticuerpo anti-CD20 es RITUXAN® o un fragmento del mismo o Bl o fragmento del mismo. 22.- Un método para tratar un tumor maligno CD40 que comprende el paso de administrar un anticuerpo anti-CD40L o fragmento del mismo, caracterizado porque el anticuerpo anti-CD40L o fragmento del mismo bloquea la interacción de CD40-CD40L o inhibe la señalización para CD40; y administrar un anticuerpo anti-CD20 o fragmento del jjfr^-^^i -'- mismo . 23.- El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el tumor maligno CD40+ es un linfoma de célula B o leucemia de célula B. 24.- Una terapia de combinación para el tratamiento de un tumor maligno CD40+ caracterizado porque comprende un antagonista de CD40L y por lo menos uno de los siguientes (a) un agente quimioterapéutico o una combinación de agentes quimioterapéuticos, (b) radioterapia, (c) un anticuerpo anti-CD20 o fragmento del mismo y (d) un anticuerpo anti-CD40 o fragmento del mismo. 25.- El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado además porque la radioterapia es tratamiento de radiación externa o un anticuerpo radiomarcado. 26.- El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque el anticuerpo radiomarcado se marca radiactivamente con 123I, i25I, i3:I, U1ln, 131ln, 32P, d4Cu, 67Cu, 211At, 177Lu, 90Y, 186Re, 212Pb, 21B?, 47Sc, 105Rh, 109Pd, 153Sm, 188Re, 199Au, 211At, y 213Bi . 27.- La terapia de combinación de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada además porque el tumor

1-Ürtrt?l?Íf ¡Éfak- - - ** *-» ****» ****-^ maligno CD40+ es un linfoma de célula B o leucemia de célula B. 28.- La terapia de combinación de conformidad con la reivindicación 27, caracterizada además porque el linfoma de célula B es HD o NHL. 29.- La terapia de combinación de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el NHL es de grado bajo, grado intermedio o grado alto. 30.- La terapia de combinación de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el NHL se selecciona del grupo de subtipos que consiste de: célula linfocítica pequeña, folicular y disociada predominantemente pequeña, tipo celular folicular y pequeña disociada y grande mezcladas, tipo celular folicular y predominantemente grande, célula pequeña disociada difusa, célula pequeña y grande difusas mezcladas, célula grande difusa, de tipo de célula grande inmunoblástica, linfoblástica, pequeña no disociada de Burkitt y de tipo no Burkitt, lmfomas relacionados con SIDA, linfoadenopatía angioinmunoblástica, linfoma de célula del manto y linfoma de célula B monocitoide . 31.- La terapia de combinación de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque la leucemia de célula B es una leucemia de célula B crónica, leucemia linfoblástica aguda de un linaje de célula B, o leucemia linfocítica crónica de un linaje de célula B. 32.- La terapia de combinación de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada además porque el antagonista de CD40L es un anticuerpo anti-CD40L o un fragmento del mismo. 33.- La terapia de combinación de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque el anticuerpo anti-CD40L es IDEC-131 o un fragmento del mismo. 34.- La terapia de combinación de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque el fragmento anti-CD40L es Fab, Fab', scFv o F(ab')2. 35.- La terapia de combinación de conformidad con la reivindicación 24, caracterizada además porque el anticuerpo anti-CD40L es RITUXAN® o un fragmento del mismo o Bl o un fragmento del mismo. 36.- La terapia de combinación de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el agente quimioterapéutico para tratar HD es cualquiera de uno o más de los siguientes: un agente alquilante, un alcaloide de vinca, procarbazina, metotrexato o prednisona. 37.- La terapia de combinación de conformidad con ^ -* :.^*ty^.SÁ.i^*£*?iAt?a &i^t.S^,- -..:.^^* la reivindicación 28, caracterizada además porque el agente quimioterapéutico para tratar NHL es cualquiera de uno o más de los siguientes: un agente alquilante, ciclofosfamida, clorambucil,

2-CDA, 2' -desoxicoformicina, fludarabma, citosina arabinósido, cisplatina, etopósido o ifosfamida. 38.- La terapia de combinación de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque la combinación de agentes quimioterapéuticos para tratar HD es: MOPP, ABVD, ChlVPP, CABS, MOPP más ABVD, MOPP más ABV, BCVPP, VABCD, ABDIC, CBVD, PCVP, CEP, EVA, MOPLACE, MIME, MINE, CEM, MTX-CHOP, EVAP o EPOCH. 39.- La terapia de combinación de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque la combinación de agentes quimioterapéuticos para tratar NHL es: CVP, CHOP, C-MOPP, CAP-BOP, m-BACOD, ProMACE-MOPP, ProMACE-CytaBOM, MACOP-B, IMVP-16, MIME, DHAP, ESHAP, CEPP(B) o CAMP. 40.- La terapia de combinación de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque el agente quimioterapéutico para tratar leucemia de célula B es: antraciclina, ciclofosfamida, L-asparaginasa, o un análogo de purina. 41.- La terapia de combinación de conformidad con la reivindicación 28, caracterizada además porque la combinación de agentes quimioterapéuticos para tratar una leucemia de célula B es: vincristina, prednisona, antraciclina y ciclofosfamida o asparaginasa; vincristina, prednisona, antraciclina, ciclofosfamida y asparaginasa; CHOP; CMP; CVP; COP o CAP. 42.- Una composición para el tratamiento de un tumor maligno CD40+ caracterizada porque comprende (i) anticuerpo anti-CD40L o fragmento de anticuerpo del mismo y por lo menos uno de los siguientes: (ii) un anticuerpo radiomarcado que se une a CD40L o CD20, (iii) un anticuerpo anti-CD20 o fragmento del mismo, o (ív) un agente quimioterapéutico o una combinación de agentes quimioterapéuticos . 43.- La composición para el tratamiento de un tumor maligno CD40+ de conformidad con la reivindicación 42 caracterizada además porque el tumor maligno es un linfoma de célula B o leucemia de célula B. 44.- La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada además porque la leucemia de célula B es enfermedad de Hodgkin o NHL. 45.- La composición de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque el anticuerpo ±?ál h??th?i?? . *.*.. ^.^ ^^ radiomarcado es IDEC-131, RITUXAN® o Bl . 46.- La composición de conformidad con ia reivindicación 42, caracterizada además porque el anticuerpo radiomarcado se marca radiactivamente con "¿3I, "I, '" I, 111 In, 64, D"Cu, °'Cu, 211 At, 177 Lu, 9 U0, , 186 Re, 212 Pb, 47Sc, :05Rh, 109Pd, 153Sm, 188Re, 199Au, 211At, y 213Bi . 47.- La composición de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada además porque el NHL es de grado bajo, grado intermedio o grado alto. 48.- La composición de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada además porque el NHL se selecciona del grupo de subtipos que consiste de: célula linfocítica pequeña, folicular y disociada predominantemente pequeña, tipo celular folicular y pequeña disociada y grande mezcladas, tipo celular folicular y predominantemente grande, célula pequeña disociada difusa, célula pequeña y grande difusas mezcladas, célula grande difusa, de tipo de célula grande inmunoblástica, linfoblástica, pequeña no disociada de Burkitt y de tipo no Burkitt, lmfomas relacionados con SIDA, lmfoadenopatía angioinmunoblást ca, linfoma de célula del manto y linfoma de célula B monocitoide . 49.- La composición de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque el anticuerpo anti-CD40L es IDEC-131 o un fragmento del mismo. 50.- La composición de conformidad con la reivindicación 42, caracterizada además porque el anticuerpo anti-CD20L es RITUXAN® o un fragmento del mismo o Bl o un fragmento del mismo. 51.- La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada además porque el agente quimioterapéutico para tratar HD es cualquiera de uno o más de los siguientes: un agente alquilante, un alcaloide de vinca, procarbazina, metotrexato o prednisona. 52.- La composición de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada además porque el agente quimioterapéuti co para tratar NHL es cualquiera de uno o más de los siguientes: un agente alquilante, ciclofosfamida, clorambucil, 2-CDA, 2' -desoxicoformicina, fludarabina, citosina arabinósido, cisplatina, etopósido o ifosfamida. 53.- La composición de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada además porque la combinación de agentes quimioterapéuticos para tratar HD es: MOPP, ABVD, ChlVPP, CABS, MOPP más ABVD, MOPP más ABV, BCVPP, V BCD, ABDIC, CBVD, PCVP, CEP, EVA, MOPLACE, MIME, MINE, CEM, MTX-CHOP, EVAP o EPOCH. ?lÍpftÍi?lhÍfÉrt?*ja¿£^fc^&^a^A-'-----,tj^j^"-- - "*-**-— *-**+*** 54.- La composición de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada además porque la combinación de agentes quimioterapéuticos para tratar NHL es: CVP, CHOP, C-MOPP, CAP-BOP, m-BACOD, ProMACE-MOPP, ProMACE-CytaBOM, MACOP-B, IMVP-16, MIME, DHAP, ESHAP, CEPP(B) o CAMP. 55.- La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada además porque el agente quimioterapéutico para tratar leucemia de célula B es: antraciclina, ciclofosfamida, L-asparaginasa, o un análogo de purina. 56.- La composición de conformidad con la reivindicación 43, caracterizada además porque la combinación de agentes quimioterapéuticos para tratar una leucemia de célula B es: vincpstma, prednisona, antraciclina y ciclofosfamida o asparaginasa; vincristina, prednisona, antraciclina, ciclofosfamida y asparaginasa; CHOP; CMP; CVP; COP o CAP. ^4..to^a ^.^^.fc^K^afadtoÉtt-.a,^