大鼠肿瘤坏死因子-β(TNF-β)ELISA试剂盒

大鼠肿瘤坏死因子-(TNF-)ELISA试剂盒

(用于血清、血浆、组织匀浆、细胞培养上清液和其它生物体液内)

原理

本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA法。用抗大鼠 TNF- 单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的 TNF-与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠TNF-，形成**复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的Streptavidin与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，*后加终止液硫酸，在450nm处测OD值，TNF-浓度与OD值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中TNF-浓度。

试剂盒组成（2-8℃保存）

准备试剂与收集血样

1. 10×标本稀释液用蒸馏水作1:10倍稀释（示例：1ml浓稀释液+9ml蒸馏水）。
2. 收集标本：血清、血浆（EDTA、柠檬酸盐、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测，2-8℃保存48小时；更长时间须冷冻（-20 ℃或-70 ℃）保存，避免反复冻融。
3. 标准品液配制：取8个1.5ml离心管，**管加标本稀释液900ul，**至第八管加入标本稀释液500ul。在**管中加入20ng/ml的标准品溶液100ul置于漩涡混合器上混匀后用加样器吸出500ul，移至**管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出500ul弃去。第八管为空白对照。
4. 洗涤液：用重蒸水1:20稀释（示例：1ml浓缩洗涤液加入19ml的重蒸水）

检测程序

1. 加样：每孔各加入标准品或待测样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃40分钟。
2. 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4-6次，向滤纸上印干。
3. 每孔加入蒸馏水和**抗体工作液各50ul(空白除外)。将反应板充分混匀后置37℃20分钟。
4. 洗板：同前。
5. 每孔加酶标抗体工作液100ul。将反应板置37℃10分钟。
6. 洗板：同前。
7. 每孔加入底物工作液100ul，置37 ℃暗处反应15分钟。
8. 每孔加入100ul终止液混匀。
9. 30分钟内用酶标仪在450nm处测吸光值。

结果计算与判断

1. 所有OD值建议减除空白值后再行计算。如空白OD低于0.1，也可以直接计算。
2. 以标准品2000、1000、500、250、125、62.5、31.2、0 pg/ml为横坐标，OD值为纵坐标，使用软件作图，画出标准曲线。
3. 根据样品OD值计算出相应TNF-含量。软件可以向本公司邮件索取。

试剂盒性能

            1. 灵敏度：*小的TNF- 检测浓度小于15pg/ml。

2. 特异性：可同时检测重组或天然的大鼠TNF-。不与大鼠其它细胞因子有交叉反应。
3. 重复性：板内、板间变异系数均小于11％。

注意事项

            1. 以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。

2. 洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致**度误差及OD值错误地升高。

            3. 检测时所有试剂都要恢复到室温。板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥。

            4. 试剂盒使用超敏TMB溶液，若显色过深会出现絮状物，属正常现象，不影响结果判读。

            5. 说明书中试剂盒组成为96T的量，48T的量应减半！

6. 本试剂盒宜置4oC冰箱保存。仅用于科研，不能用于临床诊断！