Discovery Studio分子进化助力高效合成井冈霉烯胺:一种基于底物-酶结合能分析的氨基转移酶改造

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Discovery Studio分子进化助力高效合成井冈霉烯胺:一种基于底物-酶结合能分析的氨基转移酶改造
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理性

Discovery Studio

技术一流 服务一流

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摘要

在生物合成领域,氨基转移酶(Aminotransferase, AT)是一类重要的酶,它们通过转移氨基团来催化各种生物化学反应。上海交通大学微生物代谢国家重点实验室崔莉研究员团队发表在《ACS Catalysis》上的研究为我们展示了如何通过Discovery Studio软件的分子进化策略,改造一种特定的氨基转移酶,以提高其在合成具有药用价值的井冈霉烯胺(Valienamine)方面的效率(论文标题:Molecular Evolution of an Aminotransferase Based on Substrate–Enzyme Binding Energy Analysis for Efficient Valienamine Synthesis)。井冈霉烯胺是一种具有氨基环醇结构的化合物,广泛应用于制药和农业化学品中,因其具有葡萄糖苷酶抑制活性而备受关注。

 

 

 

Discovery Studio分子进化助力高效合成井冈霉烯胺:一种基于底物-酶结合能分析的氨基转移酶改造

引言

井冈霉烯胺的化学合成过程复杂,涉及到多个立体羟基和氨基手性中心的构建,这在化学方法中难以实现,且往往需要额外的保护/去保护和分离步骤。此外,微生物降解法虽然可以生产井冈霉烯胺,但其降解效率和特异性较低。因此,开发一种高效、直接的生物合成方法具有重要意义。

 

 

 

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研究背景和目标

在这项研究中,研究人员利用了一种来自大肠杆菌的糖氨基转移酶(Sugar Aminotransferase, SAT)WecE_Eco,该酶自然催化在胸苷二磷酸(Thymidine Diphosphate, TDP)糖上的氨基组装。研究人员发现,通过将WecE_Eco应用于非天然底物井冈霉烯酮(Valienone)的转氨反应,可以合成井冈霉烯胺,但这种转氨活性较低,限制了其实际应用。为了解决这一问题,研究人员采用了一种定制的组合活性位点饱和测试/迭代饱和突变(CAST/ISM)策略,对最近鉴定的SAT(RffA_Kpn)使用Discovery Studio计算突变能进行工程改造,以优化井冈霉烯酮在大结合口袋中的结合,从而提高转氨活性。

 

 

 

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研究方法和结果

作者首先通过同源序列搜索,鉴定了具有对非天然底物井冈霉烯酮活性的新SAT候选酶。通过对这些候选酶的转氨酶活性进行测定,发现来自肺炎克雷伯菌MGH 78578(UniProt ID:A6TGH9)的TDP-Glc4O SAT RffA_Kpn在井冈霉烯酮转氨反应中表现出最高的活性,其活性是WecE_Eco的2.28倍。由于RffA_Kpn对天然和非天然底物的这种特异性活性的差异尚不清楚,需要解决酶向瓦氏酮的转氨活性的分子进化。

 

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为了提高RffA_Kpn对井冈霉烯酮的结合亲和力,作者进行了分子动力学模拟(PDB ID:6BLG),预测了井冈霉烯酮-PMP(磷酸甲酯吡哆醛)与RffA_Kpn的结合构象。

 

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与随机突变相比,CAST/ISM策略通过构建小而智能的突变库,可以显著减少筛选工作量,这些突变库针对的是底物结合口袋内的残基,因此作者需要找到底物结合口袋内的所有残基。

 

有文献认为,如果两个残基的 Cβ 原子(甘氨酸为 Cα)之间的距离小于 8 Å,则认为它们形成接触(一般而言,配体附近5 Å足矣)。作者基于此理论,总共鉴定了RffA_Kpn结合口袋中井冈霉烯酮-PMP周围8 Å接触距离内的62个残基,为了避免盲目地工作,作者希望找到热点氨基酸来减少文库构建和筛选的工作量,因此使用了计算机进行虚拟突变,以识别可能改善井冈霉烯酮-PMP结合的残基。在野生型(WT)RffA_Kpn中,valienone-PMP以不期望的(不利于催化)构象结合。因此,作者的突变工作旨在破坏这种结合模式,以产生一种替代的、有利于催化的结合构象,从而提高酶的活性。

 

作者使用了Discovery Studio软件的Calculate Mutation Energy (Binding)功能进行了虚拟单点饱和突变,软件总共给出了1240个预测结果,突变能范围从-32.89到6.41 kcal / mol(突变能0.5 kcal / mol的突变就意味着可以降低酶活性)。通过统计分析计算的突变结合能,研究人员确定了9个关键不稳定氨基酸残基,这些残基对井冈霉烯酮-PMP 与 RffA_Kpn 的不良结合具有统计学显着的预测不稳定作用,因此可以构建相对较小的集中文库以加速鉴定所需的酶突变。

 

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通过定点饱和突变,研究人员验证了这些热点残基对活性的影响,并进一步通过迭代突变,制备了组合突变体。最终,四重突变体M4(K209W/Y321F/V318Q/K25W)在井冈霉烯胺合成活性上比野生型RffA_Kpn提高了35.59倍,并在100毫克的制备规模反应中实现了12.18%的井冈霉烯酮转化率。

 

 

 

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研究意义

这项研究不仅展示了如何通过通过Discovery Studio软件的分子进化策略改造酶,以提高其对非天然底物的催化效率,还为合成具有药用价值的井冈霉烯胺提供了一种新的生物合成途径。通过这种策略,研究人员能够显著提高井冈霉烯胺的合成效率,这对于制药和农业化学品的开发具有重要意义。

 

 

 

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结论

研究人员通过半理性设计策略,结合热点选择和体外进化,成功改造了RffA_Kpn,使其能够更有效地催化井冈霉烯酮的转氨反应,生产井冈霉烯胺。这一成果不仅展示了氨基转移酶在合成小分子非天然底物方面的潜力,也为未来的酶工程提供了一种新的策略。

 

 

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结语

这项研究的成功不仅在于提高了井冈霉烯胺的合成效率,更在于展示了如何通过科学的方法改造酶,以适应工业生产的需求。随着生物技术的不断进步,我们可以期待更多类似的突破,为人类健康和农业发展带来更多的创新解决方案。

 

 

 

E n d

 

 

 

 

 

Discovery Studio软件介绍

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

BIOVIA Discovery Studio 是一款生命科学分子模拟软件,它为研究人员提供了一个完整的工具集,用于探索蛋白质化学的细微差别并促进小分子和大分子治疗药物的发现,帮助研究人员在抗体开发过程中扮演重要角色。

 

此外,DS软件还提供了抗体自动建模,可以轻松快速地从一组轻链和重链抗体序列以及经过策划的 PDB 抗体模板数据库生成高质量的 3D 抗体全长、Fab 或 Fv 模型(也可以实现对纳米抗体和双特异性抗体的3D建模)。

 

除此之外还提供了对抗体人源化建议和预测抗体及辅料对抗体的聚集效应。这些工具可以帮助研究人员更好地理解抗体的性质,并在开发和配方过程中尽早改进这些性质,从而加快产品上市的速度和降低总成本。

 

 

 

 

公司介绍

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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